附件：B群鏈球菌核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2021年第24號）.doc

B群鏈球菌核酸檢測試劑注冊技術(shù)
審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對B群鏈球菌核酸檢測試劑注冊申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評部門對注冊申報(bào)資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對B群鏈球菌核酸檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）在蘭氏抗原分類中屬于B群，B群目前只發(fā)現(xiàn)這一種細(xì)菌，所以一般也稱為B群鏈球菌（Group B Streptococcus，GBS）。GBS為一種β溶血的革蘭陽性球菌，成對或呈短鏈狀排列，根據(jù)細(xì)菌的莢膜多糖不同，GBS可分為Ia、Ib、Ic、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX等。GBS是圍產(chǎn)期和新生兒感染疾病的致病菌，引起孕產(chǎn)婦的絨毛膜羊膜炎，導(dǎo)致流產(chǎn)、胎膜早破及宮內(nèi)感染，也可導(dǎo)致新生兒發(fā)生肺炎、腦膜炎、敗血癥等。2018年孕前和孕期保健指南中提到對高危因素的孕婦妊娠35～37周進(jìn)行GBS篩查。

本指導(dǎo)原則所述GBS核酸檢測試劑指基于分子生物學(xué)相關(guān)方法的核酸檢測技術(shù)，以GBS核酸序列為檢測靶標(biāo)，對來自人體樣本（如孕婦陰道拭子、直腸拭子、陰道和直腸聯(lián)合拭子）或經(jīng)增菌培養(yǎng)后人體樣本中的GBS進(jìn)行體外定性檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，用于GBS感染實(shí)驗(yàn)室診斷及臨床應(yīng)用。

本指導(dǎo)原則適用于基于實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-time polymerase chain reaction）檢測方法的GBS核酸檢測試劑。對于其他方法，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進(jìn)行評價(jià)或補(bǔ)充其他的評價(jià)資料進(jìn)行相應(yīng)性能的驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并說明替代方法的科學(xué)合理性。

二、注冊申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、不同臨床型別檢出能力、樣本類型、樣本采集與制備方式等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

（二）主要原材料的研究資料

提供主要原材料如引物、探針、酶、陰性對照、陽性對照、內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以及企業(yè)參考品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。詳細(xì)說明基因位點(diǎn)選擇的依據(jù)，并提供能夠覆蓋臨床型別的證據(jù)。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定，并提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料購自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：供貨商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告或性能指標(biāo)證書，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。    

申報(bào)試劑的質(zhì)控體系通過設(shè)置陽性、陰性、內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）等各種對照來實(shí)現(xiàn)，需考慮對樣本核酸提取/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果的質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對各種對照的Ct值或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確的范圍要求。

1.內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）

內(nèi)對照可對實(shí)驗(yàn)過程可能存在的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物、儀器、試劑和操作等所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。申請人應(yīng)對內(nèi)對照的引物、探針和模板濃度做精確的驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶核酸序列檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。

2.陽性對照

陽性對照可對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行質(zhì)控。陽性對照建議采用含有靶核酸序列的GBS菌株或者人工構(gòu)建的質(zhì)粒等，企業(yè)應(yīng)對陽性對照的Ct值做出明確的范圍要求。

3.陰性對照

陰性對照對可能存在的交叉污染產(chǎn)生的假陽性結(jié)果或擴(kuò)增反應(yīng)中背景值進(jìn)行質(zhì)量控制。陰性對照應(yīng)參與樣本處理和檢測的全過程。建議采用與實(shí)際檢測樣本具有相同或相似性狀的基質(zhì)溶液作為陰性對照，不推薦采用水作為陰性對照。

4.PCR組分的主要材料（包括脫氧三磷酸核苷、引物和探針、各種酶等主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

4.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等詳細(xì)驗(yàn)證資料。

4.2引物和探針：

應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，針對所有預(yù)期適用型別進(jìn)行檢出能力和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價(jià)，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。

如為外購，引物和探針應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的質(zhì)檢證明，如純度（應(yīng)達(dá)到電泳級或HPLC級）、序列準(zhǔn)確性等，申請人應(yīng)對引物和探針核酸序列準(zhǔn)確性、純度、濃度、探針標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物等進(jìn)行核實(shí)，同時(shí)申請人應(yīng)進(jìn)行功能性驗(yàn)證，并提供相關(guān)資料。

4.3 PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對酶活性有合理驗(yàn)證；應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能性實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證資料。

5.企業(yè)參考品

申請人應(yīng)提供企業(yè)參考品的詳細(xì)制備過程，包括組成、來源、菌株特性（如名稱、型別、靶核酸的拷貝數(shù)/細(xì)菌濃度等）信息。企業(yè)參考品的項(xiàng)目應(yīng)包括：陰性參考品、陽性參考品、最低檢測限參考品、精密度參考品等。陽性參考品、最低檢出限參考品應(yīng)能覆蓋臨床常見型別，至少包括Ia、Ib、III、V等。陽性參考品、最低檢測限參考品、精密度參考品等建議采用滅活的菌株。陰性參考品應(yīng)至少包含分析性能研究資料中交叉反應(yīng)必須驗(yàn)證的微生物。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇（如對樣本采集拭子和保存液的驗(yàn)證，樣本類型為增菌后的人體樣本，需驗(yàn)證配套的增菌培養(yǎng)基），提供相關(guān)的研究資料。

4.核酸提取/純化方法確定的研究資料。

5.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量及反應(yīng)體積等以及PCR各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

6.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件的對比分析，如果有差異應(yīng)分別詳述。   

（四）分析性能研究資料

申請人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗(yàn)證階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，對于每項(xiàng)分析性能的評價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評價(jià)的實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進(jìn)行，建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1.GBS DNA提取

細(xì)菌DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無論申報(bào)產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細(xì)的驗(yàn)證。臨床標(biāo)本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見的DNA分離純化方法和改良方法各有優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

2.最低檢出限

2.1最低檢測限的確定

建議使用GBS菌株的梯度稀釋液來確定最低檢測限。每個(gè)梯度進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測，將具有95%陽性檢出率的最低菌株濃度作為最低檢測限。應(yīng)明確每份菌株的來源、濃度、制備方法等信息。

2.2最低檢測限的驗(yàn)證

建議使用最低檢測限水平的菌株濃度，對不同來源的GBS菌株或真實(shí)臨床樣本進(jìn)行至少20次的重復(fù)驗(yàn)證，陽性檢出率不低于95%。注冊申請人應(yīng)能夠提供用于最低檢測限驗(yàn)證的各個(gè)菌株或臨床樣本的來源、制備方法及濃度等信息。最低檢測限建議采用菌落形成單位（CFU）和靶核酸的拷貝數(shù)兩種方法分別進(jìn)行研究。

最低檢測限的確定和驗(yàn)證需要覆蓋臨床常見型別，至少包括Ia、Ib、III、V等。

3.反應(yīng)性（包容性）

建議使用具有時(shí)間和區(qū)域特征性的不同來源的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，至少包括GBS臨床常見型別，如Ia、Ib、III、V等。建議在略高于最低檢測限濃度進(jìn)行研究，并提供樣本的來源、濃度、菌株型別的確認(rèn)方法等信息。

4.精密度

注冊申請人應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。精密度研究需要覆蓋臨床常見臨床型別，至少包括Ia、Ib、III、V等。精密度評價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。針對本類產(chǎn)品的精密度評價(jià)主要包括以下要求。

4.1對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對分析儀、操作者、地點(diǎn)、檢測輪次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

4.2設(shè)定合理的精密度評價(jià)周期，例如：為期至少20天的檢測，具體方案可參考EP文件進(jìn)行。從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價(jià)。

4.3用于精密度評價(jià)的菌株或臨床樣本均應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強(qiáng)）陽性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅R床樣本精密度評價(jià)中的每一次檢測均應(yīng)從核酸提取開始。

4.3.1陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或?yàn)榱銤舛?，陰性檢出率為100%（n≥20）；

4.3.2臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率為100%（n≥20）；

4.3.3中/強(qiáng)陽性樣本：待測物濃度呈中度到強(qiáng)陽性，陽性檢出率為100%且CV≤5%（n≥20）。

5.特異性

5.1交叉反應(yīng)

5.1.1用于GBS檢測試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面：近緣菌、易引起相同或相似的臨床癥狀微生物、感染部位的定植菌等（推薦種類見表1）。

5.1.2建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 CFU/mL或更高，病毒為105 PFU/mL或更高。

5.1.3申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

5.2干擾物質(zhì)

建議注冊申請人根據(jù)所采集的樣本類型，針對可能存在的干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）進(jìn)行評價(jià)，并在GBS臨界陽性水平進(jìn)行檢測。潛在干擾物質(zhì)的選取應(yīng)至少包括：血紅蛋白、白細(xì)胞、宮頸粘液、女性衛(wèi)生用品、陰道用抗真菌藥物等。

6.提供企業(yè)參考品驗(yàn)證資料：根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（如適用）。

7.其他需注意問題

對于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用儀器】項(xiàng)中所列的所有型號儀器的性能評估資料。如適用于不同樣本類型，應(yīng)針對不同樣本類型分別驗(yàn)證。

（五）陽性判斷值研究資料

陽性判斷值確定資料主要指對申報(bào)產(chǎn)品核酸檢測的Ct值，即結(jié)果判斷的臨界值進(jìn)行確認(rèn)的資料。陽性判斷值研究資料樣本來源應(yīng)考慮不同年齡、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報(bào)試劑用于結(jié)果判斷的臨界值。有關(guān)ROC曲線分析的細(xì)節(jié)，請參考國內(nèi)外相關(guān)的文件。如采用其他方法對陽性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說明其合理性。提供內(nèi)標(biāo)值的確定方法和研究資料。閾值設(shè)置應(yīng)科學(xué)合理。

另外，考慮建立陽性判斷值時(shí)使用的臨床樣本對于目標(biāo)人群的代表性，建議通過臨床評價(jià)進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段即對儲存樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價(jià)。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項(xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（七）臨床評價(jià)資料

臨床試驗(yàn)的開展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。

1.臨床試驗(yàn)方法

該產(chǎn)品可選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑或選擇病原體增菌培養(yǎng)鑒定作為臨床參考標(biāo)準(zhǔn)，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對比試驗(yàn)研究，評價(jià)考核試劑的臨床性能。對比試劑的選擇應(yīng)從預(yù)期用途、樣本要求、檢測性能等方面，確認(rèn)其與考核試劑具有較好的可比性。

若選擇境內(nèi)已上市產(chǎn)品作為對比試劑，除與同類產(chǎn)品的對比試驗(yàn)之外，應(yīng)再選擇一定量的樣本與病原體增菌培養(yǎng)鑒定比對評價(jià)考核試劑的臨床靈敏度和特異性。

2.受試者選擇和樣本例數(shù)

2.1受試者選擇：臨床試驗(yàn)受試者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品聲稱的適用人群進(jìn)行選擇，受試人群應(yīng)能夠代表目標(biāo)人群的特征，包括各種可能的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本（其它病原體陽性）等。

2.2樣本例數(shù)

臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算，同時(shí)應(yīng)滿足法規(guī)最低樣本量的要求。根據(jù)相應(yīng)臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本臨床試驗(yàn)可依據(jù)考核試劑相對于對比試劑的陰、陽性符合率或相對于臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度和特異度分別估算最低陰、陽性樣本例數(shù)。

以已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑的比較研究中，臨床樣本量的估算建議采用公式（1）計(jì)算，陰陽性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于95%。當(dāng)評價(jià)指標(biāo)P接近100%時(shí)，該樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。

公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為考核試劑評價(jià)指標(biāo)預(yù)期值。

以病原體增菌培養(yǎng)鑒定作為對比方法，臨床陽性樣本量的估算建議采用公式（1）計(jì)算，臨床靈敏度可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于90%。陰性樣本量的估算可不采用目標(biāo)值法，建議根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的特異度的預(yù)期值P采用公式（2）計(jì)算，Δ的取值建議不大于0.03，P和Δ的取值應(yīng)有充分依據(jù)，當(dāng)預(yù)期值P更高時(shí)應(yīng)考慮更優(yōu)的精度。

公式中n為樣本量，Z1-α/2為置信度標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分位數(shù)，P為評價(jià)指標(biāo)預(yù)期值，Δ為P的允許誤差大小。

對于選擇境內(nèi)已上市產(chǎn)品作為對比試劑，除同類產(chǎn)品比對試驗(yàn)之外，應(yīng)再選擇一定量的樣本與病原體增菌培養(yǎng)鑒定比對評價(jià)考核試劑的臨床靈敏度和特異性，該部分試驗(yàn)陰、陽性樣本量的估計(jì)建議采用公式（2）進(jìn)行估算，其中Δ的常用取值為0.05，當(dāng)預(yù)期值更高時(shí)應(yīng)考慮更優(yōu)的精度。

臨床試驗(yàn)總體樣本量確定時(shí)應(yīng)在上述陰、陽性樣本最低樣本量估算的基礎(chǔ)上，同時(shí)考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及可能需要納入的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本等情況適當(dāng)增加入組樣本量。

此類產(chǎn)品的檢測樣本類型一般為直腸拭子、陰道拭子或直腸/陰道混合拭子，如果樣本類型同時(shí)包括直腸拭子和陰道拭子，鑒于同一病例其陰道和直腸感染狀態(tài)可能存在差異，因此對于這兩種拭子應(yīng)分別和對比試劑或臨床參考標(biāo)準(zhǔn)比對進(jìn)行驗(yàn)證，不同拭子樣本量均應(yīng)分別滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，不宜使用同源比對的方法進(jìn)行評價(jià)。

3.臨床研究單位的選擇

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）已備案的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇應(yīng)充分考慮擬申報(bào)產(chǎn)品的特點(diǎn)和預(yù)期用途，綜合流行病學(xué)背景，鑒于不同地區(qū)及醫(yī)療機(jī)構(gòu)中GBS血清型的差異，建議選擇不同地區(qū)的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)，使臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和受試者的選擇具有一定的地域代表性。且臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法和微生物培養(yǎng)檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉臨床試驗(yàn)方案。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法對臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對于考核試劑與對比試劑/參考方法的一致性評價(jià)，常選擇交叉四格表形式總結(jié)兩種試劑的檢測結(jié)果，評價(jià)指標(biāo)一般包括臨床靈敏度、臨床特異度、陽性符合率、陰性符合率，kappa值等，對于不一致樣本，應(yīng)進(jìn)行可能的原因分析，如臨床試驗(yàn)方案規(guī)定采用其他方法進(jìn)行確認(rèn)，則確認(rèn)結(jié)果不應(yīng)納入統(tǒng)計(jì)分析。

5.倫理學(xué)要求

臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對受試者的風(fēng)險(xiǎn)，提請倫理委員會審查，并獲得倫理委員會的同意。注冊申報(bào)時(shí)應(yīng)提交倫理委員會的審查意見。

6.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)執(zhí)行統(tǒng)一的臨床試驗(yàn)方案，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。

7.質(zhì)量控制

臨床試驗(yàn)開始前，建議進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。整個(gè)試驗(yàn)過程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及精密度。

8.臨床試驗(yàn)報(bào)告撰寫

臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫參考《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、前期評價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。產(chǎn)品技術(shù)要求還應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。

如申報(bào)試劑已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢驗(yàn)要求。

（九）注冊檢驗(yàn)

根據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。如申報(bào)試劑有適用的國家參考品，應(yīng)采用國家參考品進(jìn)行注冊檢驗(yàn)，并符合國家參考品的相關(guān)要求。

（十）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、樣本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

下面對B群鏈球菌核酸檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

1.1試劑盒用于對來自人體樣本（如孕婦陰道拭子、直腸拭子、陰道和直腸聯(lián)合拭子）或經(jīng)增菌培養(yǎng)后人體樣本中的GBS進(jìn)行體外定性檢測。適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報(bào)產(chǎn)品的分析性能評估和臨床研究情況進(jìn)行確認(rèn)。

1.2目標(biāo)物的特征：簡要描述病原體生物學(xué)特征及致病性，感染后臨床表現(xiàn)，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法等。

1.3目標(biāo)人群：例如妊娠35～37周高危因素的孕婦（如合并糖尿病、前次妊娠出生的新生兒有B群鏈球菌感染等），有胎膜早破、先兆早產(chǎn)等臨床癥狀醫(yī)生認(rèn)為有必要進(jìn)行GBS檢測的其他孕周數(shù)孕婦等，不建議使用該試劑盒對無癥狀的孕早、中期孕婦進(jìn)行篩查。

1.4產(chǎn)品功能：結(jié)合目標(biāo)人群的臨床表現(xiàn)和其他診斷指標(biāo)，可用于B群鏈球菌感染的輔助診斷。

2.【檢驗(yàn)原理】

2.1描述試劑盒檢測能夠覆蓋的目標(biāo)基因序列特征，引物及探針的設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系（管）組合形式，內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）和陰陽質(zhì)控品的設(shè)置及熒光信號標(biāo)記等。

2.2描述核酸提取純化的方法、原理等。

2.3描述試劑盒的技術(shù)原理，可結(jié)合圖示進(jìn)行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染組分（如尿嘧啶糖基化酶），也應(yīng)介紹其作用機(jī)理。

3.【主要組成成分】

3.1詳細(xì)說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性。說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，應(yīng)在此明確經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、備案號以及配合使用的儀器等信息。

3.3試劑盒中不包含但對該項(xiàng)檢測必需的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及備案憑證號或注冊證號（如有）等信息。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲存條件及效期。

5.【適用儀器】

注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】

6.1樣本收集要求：結(jié)合臨床公認(rèn)推薦的采樣要求。建議注明配套驗(yàn)證的拭子種類或生產(chǎn)廠家。

6.2樣本處理、運(yùn)送及保存：如果使用增菌培養(yǎng)后的人體樣本建議注明配套使用的增菌培養(yǎng)基。核酸提取前的預(yù)處理、保存條件及時(shí)間、運(yùn)輸條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復(fù)室溫，凍融次數(shù)限制等。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說明操作的各個(gè)步驟，例如：

7.1試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項(xiàng)。

7.2詳細(xì)描述待測樣本、質(zhì)控品的核酸提取/純化方法，包括條件、步驟及注意事項(xiàng)。

7.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.4 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及注意事項(xiàng)。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況設(shè)置目標(biāo)基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道。

7.6基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

7.7質(zhì)量控制方法：試劑盒內(nèi)陰/陽性質(zhì)控品、內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的Ct值范圍要求。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照、內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以及目標(biāo)基因的檢測結(jié)果，以列表形式詳細(xì)描述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋，可用Ct值表示。如存在灰區(qū)，應(yīng)同時(shí)說明對灰區(qū)結(jié)果的處理方式，包括在何種情況下需要進(jìn)行重復(fù)檢測，重復(fù)檢測的方法，對樣本可能采取的優(yōu)化條件（如采集要求或采集方法）等。如適用，也可結(jié)合擴(kuò)增結(jié)果的S形曲線對灰區(qū)結(jié)果進(jìn)行判定。

9.【檢驗(yàn)方法局限性】

9.1本試劑盒的檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者的癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果等情況進(jìn)行綜合分析以及解釋，不得作為患者臨床診治或管理的唯一依據(jù)。

9.2導(dǎo)致假陰性/假陽性結(jié)果的可能性分析：

9.2.1不合理的樣本采集、處理、運(yùn)輸及保存條件，樣本中目標(biāo)物濃度過低；

9.2.2 B群鏈球菌核酸目標(biāo)基因序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖儯?/p>

9.2.3同一患者不同時(shí)間、不同部位或者多次采集樣本會降低假陰性結(jié)果的可能性；

9.2.4未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾，如內(nèi)源性或外源引入樣本的物質(zhì)；

9.2.5樣本間的交叉污染；

9.2.6未經(jīng)驗(yàn)證的其他交叉反應(yīng)物質(zhì)。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

10.1最低檢出限：說明試劑的最低檢出濃度，簡單介紹最低檢出限的確定及驗(yàn)證方法。

10.2企業(yè)陽性/陰性參考品符合率：簡單介紹陽性/陰性參考品組成、來源以及濃度等信息。

10.3精密度：說明不同類型樣本的重復(fù)性和再現(xiàn)性評價(jià)結(jié)果。

10.4分析特異性：包括交叉反應(yīng)和干擾物質(zhì)

10.4.1可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式描述病原體名稱、型別、濃度等信息；

10.4.2樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，應(yīng)注明可接受的最高限值。

10.5臨床試驗(yàn)：簡要介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項(xiàng)目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項(xiàng)檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對待。

11.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》配備設(shè)備及操作人員，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

三、參考文獻(xiàn)

1.《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）.2014年7月

2.《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》，（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第16號）.2014年9月

3.《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》，（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第17號）.2014年9月

4.《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（原國家食品藥品監(jiān)管總局公告2014年第44號）.2014年9月

5.中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會產(chǎn)科學(xué)組，孕前和孕期保健指南（2018），中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2018年3月第21卷第3期：145-152.

四、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心