附件：EB病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2020年第16號）.doc

EB病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對EB病毒核酸檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對EB病毒核酸檢測試劑技術(shù)審查的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細闡明理由，并對其科學(xué)合理性進行驗證，提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

EB病毒（Epstein－Barr virus，EBV）為皰疹病毒科，皰疹病毒IV型，是一種嗜人類淋巴細胞的皰疹病毒。EBV是雙鏈DNA病毒，基因組長約172kb，在病毒顆粒中呈線性分子，進入受感染細胞后，其DNA發(fā)生環(huán)化并能自我復(fù)制。淋巴細胞中潛伏感染的EBV可表達2種不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA（即EBV-encoded RNAs，EBERs），包括EBER1和EBER2，6種核抗原（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C和LP），2種潛伏期膜蛋白（潛伏膜蛋白，latent membrane protein，LMP），包括LMP1、LMP2A/B。

EBV在人群中感染非常普遍。除原發(fā)性EBV感染可致傳染性單核細胞增多癥外，EBV還引起慢性活動性EBV感染和EBV相關(guān)噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥等非腫瘤性重癥EBV相關(guān)疾病。EBV還與許多腫瘤的診療相關(guān)。針對不同的EBV感染相關(guān)疾病，選擇適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本和實驗室檢測方法，對于EBV感染相關(guān)疾病的診斷和治療十分重要。

本指導(dǎo)原則所述EB病毒核酸檢測試劑指基于分子生物學(xué)相關(guān)方法的核酸檢測技術(shù)，以EB病毒核酸序列為檢測靶標(biāo)，對來自人體樣本（如全血、血漿、血清等）中的EB病毒進行體外定量檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實驗室指標(biāo)，本類產(chǎn)品可用于EB病毒感染實驗室診斷及臨床應(yīng)用。

本指導(dǎo)原則適用于基于實時熒光PCR（Real-time polymerase chain reaction，qPCR）等核酸檢測方法的EB病毒核酸檢測試劑。對于EB病毒定性檢測或其他方法，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進行評價或補充其他的評價資料進行相應(yīng)性能的驗證，但需闡述不適用的理由，并說明替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于進行產(chǎn)品注冊和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及病原體檢出能力等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。對于本類申報產(chǎn)品，應(yīng)著重從樣本類型、樣本采集與制備方式、目標(biāo)基因片段的選擇、方法學(xué)特征等方面描述。

（二）主要原材料的研究資料

此類產(chǎn)品的主要原材料應(yīng)包括EB病毒檢測試劑的所有主要組成成分，如引物、探針、酶、提取成分等。如為申請人自行研制的主要原材料，申請人應(yīng)對EB病毒目的基因序列確定、引物和探針選擇、酶的選擇和驗證等實驗過程予以詳述；并提供對各主要原材料的性能研究資料，如：外觀、純度、蛋白濃度、功能性研究等。制備完成的原料成品應(yīng)進行質(zhì)量檢驗以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，整個生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請人外購主要原材料，應(yīng)詳述每一原材料外購方來源，提交外購方出具的原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并詳述申請人對外購主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細依據(jù)。

1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

2.PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應(yīng)提交對其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗證資料。

2.2引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，并對序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等的驗證。如為外購，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

2.3探針

特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5'-端（和/或3'-端）進行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達到HPLC純。應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜，應(yīng)對探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光基團進行核實，并進行功能性試驗驗證。

2.4酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對酶活性進行合理驗證。

3.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

4.企業(yè)內(nèi)部參考品：

企業(yè)內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過程、定值研究、評價指標(biāo)、統(tǒng)計學(xué)分析等。建議采用滅活病毒的臨床樣本或細胞培養(yǎng)后的病毒株建立參考品，并溯源至國際參考物質(zhì)/國家參考品（如有），不宜使用質(zhì)粒。內(nèi)標(biāo)設(shè)置應(yīng)合理，陰/陽性質(zhì)控品宜采用混合臨床樣本或病毒株或假病毒制備。試劑盒中包含的定量標(biāo)準(zhǔn)品可采用臨床樣本或病毒株、假病毒或質(zhì)粒等制備。

內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以對管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進行質(zhì)控。申請人應(yīng)對內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線，不應(yīng)對目的基因的檢測造成競爭性抑制而導(dǎo)致假陰性，對內(nèi)標(biāo)的Ct應(yīng)有明確的范圍要求。

陰/陽性質(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對整個PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對各種質(zhì)控品的Ct做出明確的范圍要求。

企業(yè)應(yīng)提交詳細的溯源性研究資料。企業(yè)制備的企業(yè)內(nèi)部參考品、商品化校準(zhǔn)品均應(yīng)能夠溯源至國際參考物質(zhì)/國家參考品（如有）。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH等關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究的資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準(zhǔn)方法、質(zhì)控方法、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.DNA提取純化方法優(yōu)化，建議包含純化步驟，內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控品均應(yīng)全程參與提取純化。

3.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量、加樣量及反應(yīng)體積等。

4.確定PCR各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

5.對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

6.不同適用機型的反應(yīng)條件的對比分析，如果有差異應(yīng)分別詳述。

（四）分析性能研究資料

申請人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗證階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應(yīng)包括具體研究目的、實驗設(shè)計、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細資料。有關(guān)分析性能驗證的背景信息也應(yīng)在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點（實驗室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評價的實驗方法可以參考相關(guān)的美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進行，建議著重對以下分析性能進行研究。

1.EB DNA提取

病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細的驗證。臨床標(biāo)本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見的DNA分離純化方法和改良方法各有優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料（提取效率、與后續(xù)試驗的配合等）。

2.最低檢出限與定量限（分析靈敏度）

（1）最低檢出限與定量限的確定

建議使用國際參考物質(zhì)/國家參考品（如有）進行梯度稀釋并多次檢測，并建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。

定量限應(yīng)高于或等于檢出限，將多次（至少20次）測量的結(jié)果符合試劑準(zhǔn)確度要求的最低病毒水平作為定量限。

（2）最低檢出限和定量限的驗證

申報試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限、定量限的病毒濃度進行驗證。

企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限/定量限驗證的病毒株的來源、及濃度確認(rèn)試驗等信息。不同樣本類型（如涉及），應(yīng)分別評價最低檢出限及定量限。

3.線性范圍

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本或病毒株按一定濃度加入血液基質(zhì)中（由可溯源至國際參考物質(zhì)/國家參考品（如有）的方法定量）進行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用經(jīng)確認(rèn)為陰性的混合人血液樣本，應(yīng)包含不少于9個濃度（應(yīng)包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個批次的試劑進行試驗。通過評價一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的準(zhǔn)確度確定該產(chǎn)品的線性范圍。不同樣本類型（如涉及），應(yīng)分別評價線性范圍。

4.準(zhǔn)確度

應(yīng)使用國際參考物質(zhì)/國家參考品（如有）或企業(yè)內(nèi)部參考品和臨床樣本進行陽性/陰性符合率或者方法學(xué)比對研究。

5.精密度

應(yīng)對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，評估重復(fù)性和重現(xiàn)性，包括運行內(nèi)的變異和運行間、日內(nèi)、日間、批次間、操作者間、儀器間和地點間的變異。

建議設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期12天的檢測，每天由2人完成不少于2次的完整檢測，注意應(yīng)包括核酸分離/純化步驟?？刹捎门R床樣本進行試驗，至少包含3個濃度水平：陰性樣本、略高于最低檢測限的弱陽性樣本、中等陽性樣本。

6.特異性

（1）交叉反應(yīng)

①用于EB DNA檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類見表1）。

②建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細菌感染的水平為106 cfu/mL或更高，病毒為105 pfu/mL或更高。

③申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項中有所體現(xiàn)。

*為可選驗證的交叉反應(yīng)病原體。

（2）干擾物質(zhì)

應(yīng)針對不同樣本類型，分別評價可能存在的干擾情況。建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）進行評價，并在待測物的醫(yī)學(xué)決定水平進行檢測。潛在的干擾物質(zhì)包括內(nèi)源性、外源性和其他已報道的干擾物質(zhì)。

樣本應(yīng)至少選取全血（或血紅蛋白和白細胞）、人白蛋白、膽紅素、甘油三酯、自身抗體等進行驗證，并注明對被測物不產(chǎn)生干擾的最高限值。

7.其他需注意問題

對于適用多個機型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。如適用于不同樣本類型，應(yīng)提交對不同樣本類型一致性的驗證，包括不同抗凝劑、采血管（如涉及）的驗證。

（五）陽性判斷值研究資料

申請人應(yīng)考慮不同地理區(qū)域流行病學(xué)背景以及人口統(tǒng)計學(xué)特征（包括性別、地域、種族等因素）的差異，選擇具有代表性的樣本建立陽性判斷值，注意應(yīng)納入一定數(shù)量的弱陽性樣本。如采用其他研究方法，應(yīng)說明其合理性。

對于熒光實時PCR方法即為用于結(jié)果判讀的Ct值和/或核酸濃度的確定資料，包括確定基線閾值（threshold）、閾值循環(huán)數(shù)（Ct）、核酸濃度（如適用）的研究資料等。

另外，建議申請人考慮建立陽性判斷值時使用的受試者樣本對于目標(biāo)人群的代表性，通過臨床評價進一步驗證和確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進行研究，主要包括冷藏和冷凍等條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行主要性能的分析驗證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床評價資料

臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求。

1.試驗方法

對于EB病毒核酸檢測試劑而言，臨床試驗可采用試驗用體外診斷試劑與臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的已上市同類產(chǎn)品進行比較研究試驗，證明兩者具有等效性，從而間接證明試驗用體外診斷試劑臨床性能能夠滿足預(yù)期用途的要求。對比試劑在預(yù)期用途、適用人群、樣本類型、檢測性能等方面應(yīng)與試驗用體外診斷試劑具有較好的可比性。

對于比較研究試驗中測定結(jié)果不符的樣本，應(yīng)采用臨床檢驗實驗室已建立的參考方法或者其他合理的方法（如第三方試劑、核酸序列測定方法等）進行復(fù)核。

2.試驗機構(gòu)

應(yīng)考慮擬申報產(chǎn)品的特點和預(yù)期用途，結(jié)合流行病學(xué)背景，選擇具有一定地域代表性的試驗機構(gòu)和受試者。原則上應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測以及相關(guān)學(xué)科的優(yōu)勢，實驗操作人員有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉評價方案。

3.試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。

受試人群應(yīng)盡可能全面地代表預(yù)期適用人群。體外診斷試劑的比較研究試驗中應(yīng)對受試者樣本設(shè)盲，并使檢測順序隨機，以避免因操作者和檢測結(jié)果的評價者知曉受試者的疾病診斷或?qū)Ρ仍噭z測結(jié)果等信息而引入偏倚。

試驗用體外診斷試劑檢測應(yīng)與對比試劑的檢測同步進行，以避免因疾病進程不同或樣本采集時間不同而造成臨床試驗結(jié)論偏離真值。不同臨床試驗機構(gòu)在臨床試驗中應(yīng)盡可能統(tǒng)一試驗操作和判讀標(biāo)準(zhǔn)等。

應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，如評價試驗用體外診斷試劑與對比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)，并提出適合的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法。建議根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，對檢測樣本的類型和數(shù)量提出要求。

4.受試者

EB病毒核酸檢測應(yīng)與臨床癥狀、體征及其他診斷方法相結(jié)合，用于EB病毒感染的輔助診斷、治療監(jiān)測等。臨床試驗受試者應(yīng)包括各種可能接受EB病毒核酸感染檢查的人群，如原發(fā)性EB病毒感染相關(guān)疾?。▊魅拘詥魏思毎龆喟Y等）、慢性活動性EB病毒感染、EB病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤（鼻咽癌等）、免疫功能低下（器官移植患者等）或者接受免疫抑制劑治療等人群。另外，建議根據(jù)流行病學(xué)證據(jù)納入不同地區(qū)的患者/人群，以驗證本產(chǎn)品的臨床檢出能力。

5.樣本分布

建議至少原發(fā)性EB病毒感染、慢性EB病毒感染、EB病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤、免疫功能低下或者接受免疫抑制劑治療等人群中均應(yīng)檢測出具有EB病毒陽性的臨床結(jié)果。

其中陽性樣本應(yīng)包含一定數(shù)量的弱陽性樣本或灰區(qū)樣本，并在檢測范圍內(nèi)的不同水平均有分布。在病例選擇時可考慮具有不同臨床癥狀、體征的患者等。陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應(yīng)情況，應(yīng)選擇其他類皰疹病毒感染患者，以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應(yīng)為實際臨床檢測中常用的樣本類型。對于同時能夠檢測血清和血漿樣本的試劑，應(yīng)對同一EB病毒感染患者分別采集的血清和血漿樣本進行比對試驗研究，陽性樣本應(yīng)包括強、中、弱陽性及部分陰性樣本。臨床研究應(yīng)以前瞻性樣本為主，如采用回顧性樣本應(yīng)另行說明 。

6.樣本量

適當(dāng)?shù)臉颖玖渴潜ＷC體外診斷試劑臨床性能得到準(zhǔn)確評價的必要條件。臨床試驗樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進行估算。根據(jù)不同的預(yù)期用途，設(shè)計相應(yīng)臨床試驗，以輔助診斷用途為例，臨床試驗可依據(jù)試驗用體外診斷試劑相對于對比試劑的陰陽性符合率分別估算最低陰陽性樣本例數(shù)。

臨床樣本量的估算建議采用如下樣本量公式計算，

公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為試驗用體外診斷試劑評價指標(biāo)預(yù)期值。

其中，陰陽性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于95%。獲得臨床試驗數(shù)據(jù)后，證明產(chǎn)品相對于對比方法的陰陽性符合率（置信區(qū)間下限）不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）。當(dāng)評價指標(biāo)P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

7.統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，對于本類產(chǎn)品對比實驗的等效性研究，常用相關(guān)性、線性回歸、相關(guān)系數(shù)（r）等對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，考察兩組數(shù)據(jù)之間是否存在相關(guān)性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價考核試劑與對比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對檢驗結(jié)果進行符合率分析，計算陽性符合率、陰性符合率、總符合率和Kappa值等指標(biāo)及其可信區(qū)間。

8.結(jié)果不符的樣本

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑的檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)進行第三方復(fù)核，并結(jié)合受試者的臨床診斷信息對差異原因進行分析，但第三方復(fù)核結(jié)果不應(yīng)納入統(tǒng)計分析。如無需復(fù)核，應(yīng)詳細說明理由。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、前期臨床評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。

如果申報試劑已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢驗要求。

按照《辦法》的規(guī)定，此類產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑。申請人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的規(guī)定，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求，主要原材料部分建議包括目標(biāo)物的基因位點區(qū)域，引物/探針的設(shè)計及來源（包括目標(biāo)物和內(nèi)對照），各種酶的來源、技術(shù)指標(biāo)和驗收標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)對照和質(zhì)控品的設(shè)置和驗證情況等內(nèi)容。

（九）產(chǎn)品檢驗報告

應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品技術(shù)要求，在符合《辦法》要求的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進行連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的檢驗，提供檢驗合格報告。

（十）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗方法、檢驗結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達習(xí)慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。

下面對EB病毒核酸檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

1.1試劑盒用于定量檢測人體樣本（如全血、血漿、血清等）中的EB DNA，適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報產(chǎn)品的分析性能評估和臨床研究情況進行確認(rèn)。

1.2目標(biāo)物的特征：簡要描述病原體生物學(xué)特征及致病性，感染后臨床表現(xiàn)，相關(guān)的實驗室診斷方法等。

1.3目標(biāo)人群：各種可能接受EB病毒核酸感染檢查的人群。例如原發(fā)性EB病毒感染、慢性EB病毒感染、EB病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤、免疫功能低下或者接受免疫抑制劑治療等人群。注：未對上述目標(biāo)人群進行相關(guān)臨床研究的產(chǎn)品應(yīng)在此項下聲明：由于未做相關(guān)驗證，本產(chǎn)品不能用于相關(guān)臨床預(yù)期人群。

1.4產(chǎn)品功能：結(jié)合目標(biāo)人群的臨床表現(xiàn)和其他診斷指標(biāo)，可用于EB病毒感染的輔助診斷、治療監(jiān)測等。

2.【檢驗原理】

2.1 描述試劑盒檢測能夠覆蓋的目標(biāo)基因序列特征，引物及探針的設(shè)計，反應(yīng)體系（管）組合形式，內(nèi)對照和質(zhì)控品的設(shè)置及熒光信號標(biāo)記等。

2.2 描述核酸提取純化的方法、原理等。

2.3 描述試劑盒的技術(shù)原理，可結(jié)合圖示進行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防止擴增產(chǎn)物污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶），也應(yīng)介紹其作用機理。

3.【主要組成成分】

3.1詳細說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2 如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，應(yīng)在此明確經(jīng)驗證后推薦配合使用的核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、注冊證號（如有）以及配合使用的儀器等信息。

3.3試劑盒中不包含但對該項檢測必需的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及備案憑證號或注冊證號（如有）等信息。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲存條件及效期。

5.【適用機型】

注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】

6.1樣本收集要求：結(jié)合臨床公認(rèn)推薦的采樣要求。

6.2血液樣本應(yīng)當(dāng)說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。

6.3樣本處理、運送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。如有需要應(yīng)對高于檢測范圍的樣本稀釋方法進行規(guī)定。

7.【檢驗方法】

描述自動分析的工作流程或者詳細說明試驗操作的各個步驟，例如：

7.1試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項。

7.2詳細描述待測樣本、質(zhì)控品的核酸提取/純化方法，包括條件、步驟及注意事項。

7.3擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.4 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及注意事項。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況設(shè)置目標(biāo)基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道。

7.6基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

7.7質(zhì)量控制方法：試劑盒內(nèi)陰/陽性質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)的Ct值范圍要求。

8.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照、內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以及目標(biāo)基因的檢測結(jié)果，以列表形式詳細描述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋，可用Ct值表示。如存在灰區(qū)，應(yīng)同時說明對灰區(qū)結(jié)果的處理方式，包括在何種情況下需要進行重復(fù)檢測，重復(fù)檢測的方法，對樣本可能采取的優(yōu)化條件（如采集要求或采集方法）等。如適用，也可結(jié)合擴增結(jié)果的S形曲線對灰區(qū)結(jié)果進行判定。

9.【檢驗方法局限性】

9.1本試劑盒的檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者的癥狀/體征、病史、其他實驗室診斷結(jié)果等情況進行綜合分析以及解釋，不得作為患者臨床診治或管理的唯一依據(jù)。

9.2導(dǎo)致假陰性/假陽性結(jié)果的可能性分析：

9.2.1不合理的樣本采集、處理、運輸及保存條件，樣本中目標(biāo)物滴度過低。

9.2.2EB病毒核酸目標(biāo)基因序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖儭?/p>

9.2.3同一患者不同時間、不同部位或者多次采集樣本會降低假陰性結(jié)果的可能性。

9.2.4未經(jīng)驗證的其他干擾，如內(nèi)源性或外源引入樣本的物質(zhì)。

9.2.5樣本間的交叉污染。

9.2.6未經(jīng)驗證的其他交叉反應(yīng)物質(zhì)。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

10.1最低檢出限及定量限：說明試劑不同樣本類型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡單介紹最低檢出限/定量限的確定及驗證方法。

10.2線性范圍：確定線性范圍的方法、濃度范圍、相關(guān)系數(shù)等信息。

10.3精密度：說明不同類型樣本的重復(fù)性和重現(xiàn)性評價結(jié)果。

10.4分析特異性：包括交叉反應(yīng)和干擾物質(zhì)

10.4.1可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的驗證情況，建議以列表的方式描述病原體名稱、型別、濃度等信息。

10.4.2樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，應(yīng)注明可接受的最高限值。

10.5臨床試驗：簡要介紹試驗方法、受試者及樣本、試驗結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

（1）有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)校準(zhǔn)品、質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對待。

（2）臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》配備設(shè)備及操作人員，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求進行操作。

三、參考文獻

1.國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊管理辦法（局令第5號），2014年7月.

2.國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則，2014年9月.

3.國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則，2014年9月.

4.國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式，2014年9月.

5.全國兒童EB病毒感染協(xié)作組.EB病毒感染實驗室診斷及臨床應(yīng)用專家共識. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2018.2（32）：2-8.

6.中國抗癌協(xié)會腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會鼻咽癌標(biāo)志物專家委員會.鼻咽癌標(biāo)志物臨床應(yīng)用專家共識.中國癌癥防治雜志，2011.6（11） ：183-193.

四、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。