附件：腸道病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2018年第36號(hào)）.doc

腸道病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)腸道病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)審評(píng)注冊(cè)申報(bào)資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)腸道病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊(cè)審批等行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如有能夠滿(mǎn)足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

（一）腸道病毒簡(jiǎn)介

腸道病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，能引起人類(lèi)致病的腸道病毒有多種，包括人腸道病毒A、B、C、D組，有100多個(gè)血清型。人類(lèi)腸道病毒主要包括：脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒A組（Coxsackievirus A，CA）、柯薩奇病毒B組（Coxsackievirus B，CB）、人腸道致細(xì)胞病變孤兒病毒（簡(jiǎn)稱(chēng)?？刹《荆‥chovirus ECHO）、新腸道病毒等。新腸道病毒為1969年后陸續(xù)分離到的，例如新型腸道病毒71型（EV71）等。近年來(lái)，鼻病毒（Rhinovirus）被劃入腸道病毒屬，鼻病毒包括A、B、C組，已經(jīng)先后分離得到140多個(gè)血清型。

腸道病毒為球形，直徑28～30nm，核衣殼二十面體立體對(duì)稱(chēng)，無(wú)包膜。病毒衣殼由60個(gè)相同的殼粒組成，排列為12個(gè)五聚體，每個(gè)殼粒由VP1、VP2、VP3和VP4四種蛋白組成。

腸道病毒基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約為7.2～8.4kb，基因組分為三部分，兩端為保守的非編碼區(qū)，在腸道病毒中同源性非常顯著，其中5’端非編碼區(qū)常作為腸道病毒通用檢測(cè)試劑檢測(cè)的靶基因。中間為連續(xù)開(kāi)放讀碼框，包含結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)依次編碼VP4、VP2、VP3和VP1共４個(gè)衣殼蛋白。衣殼蛋白不僅含有抗原決定位點(diǎn)，而且還有決定病毒組織嗜性的受體識(shí)別位點(diǎn)，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的吸附和進(jìn)入。非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)主要負(fù)責(zé)編碼與病毒基因組復(fù)制以及病毒顆粒包裝等有關(guān)的蛋白及酶，它們?cè)赗NA復(fù)制、細(xì)胞器修飾，細(xì)胞裂解及形態(tài)形成中發(fā)揮各自不同的功能。

（二）腸道病毒致病性

腸道病毒在腸道中增殖，但通常不引起腸道疾病。90%以上腸道病毒感染為隱性感染，或僅出現(xiàn)輕微的上呼吸道感染或流感樣癥狀。不同腸道病毒可以引起相同的臨床癥狀，同一種病毒可引起幾種不同的臨床疾病。

腸道病毒的傳染源為患者和無(wú)癥狀的病毒攜帶者。傳播途徑主要是糞-口途徑，也可通過(guò)呼吸道傳播，夏秋季是一年之中的主要流行期。腸道病毒以上呼吸道、咽喉和腸道為侵入門(mén)戶(hù)，先在局部黏膜和咽、扁桃體等淋巴組織和腸道集合淋巴結(jié)中初步增殖，然后釋放入血，形成第一次病毒血癥。擴(kuò)散至帶有受體的靶組織，再次增殖后，引起第二次病毒血癥和臨床癥狀。脊髓灰質(zhì)炎病毒識(shí)別的受體為免疫球蛋白超家族的細(xì)胞黏附分子，只有很少的組織表達(dá)這種受體，如脊髓前角質(zhì)細(xì)胞、被根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、骨骼肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，柯薩奇病毒和?？刹《咀R(shí)別的受體在組織和細(xì)胞中分布廣泛，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心、肺、胰、黏膜、皮膚和其他系統(tǒng)等，因而引起的疾病譜復(fù)雜，大多數(shù)腸道病毒為殺細(xì)胞病毒、直接對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生裂解性感染。各年齡段人群均可感染腸道病毒。

腸道病毒所致的主要疾病有：

1.手足口?。河赡c道病毒感染而引起，以發(fā)熱，咽喉痛，全身不適，手、足、口腔等部位皮疹或皰疹為主要特征的常見(jiàn)傳染病，大多數(shù)手足口病患者癥狀輕微，并且具有自限性，但有相當(dāng)一部分患者有致死性心肺功能疾病和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，個(gè)別重癥患者病情進(jìn)展迅速，甚至可導(dǎo)致死亡。我國(guó)手足口病疫情尤為嚴(yán)峻，其已成為嚴(yán)重影響我國(guó)居民生命和健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

手足口病致病病原體傳染源為患者或隱性感染者，主要的傳播途徑為糞-口傳播，也可經(jīng)接觸患者的皰疹液傳播，接觸病人和攜帶者的糞便、唾液和皰疹液污染的日常生活用品均可傳播此病原體，近年來(lái)的報(bào)道顯示，該病原體也可垂直傳播，導(dǎo)致新生兒重癥感染。人對(duì)腸道病毒普遍易感，不同年齡組均可感染發(fā)病，以5歲以下兒童為主，尤以3歲以下兒童發(fā)病率最高，該病流行無(wú)明顯的地區(qū)性，全年均可發(fā)生，一般5—7月為發(fā)病高峰。該病的潛伏期一般為2—10天，平均潛伏期為3—5天，感染者發(fā)病前的數(shù)天即可從其咽拭子樣本和糞便樣本中檢出病毒，病程為7天左右，咽部排毒可持續(xù)在發(fā)病后1—2周，而糞便排毒可持續(xù)至發(fā)病后3—5周。

引起手足口病的腸道病毒包括柯薩奇病毒A組的2、4、5、6、7、9、10、16型等，B組的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型及?？刹《镜?，其中以EV71和CA16型較為常見(jiàn)。

2.無(wú)菌性腦膜炎：腸道病毒感染引起的一種疾病，常表現(xiàn)為短暫發(fā)熱、頭痛等，偶爾有肌肉酸痛，或伴有皮疹，重者出現(xiàn)頸項(xiàng)強(qiáng)直、嗜睡、昏迷、意識(shí)障礙、腦膜刺激征等癥狀。目前發(fā)現(xiàn)腸道病毒中有60多個(gè)血清型能引起無(wú)菌性腦膜炎，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒所有型別、柯薩奇病毒A組中的大多數(shù)型別、柯薩奇病毒B組的1—6型、?？刹《敬蠖鄶?shù)型別和腸道病毒71型等。

3.脊髓灰質(zhì)炎：是由脊髓灰質(zhì)炎病毒感染而引起的疾病，其中85%由Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒引起，在我國(guó)曾有由Ⅱ、Ⅲ型病毒感染而發(fā)病的病例。病毒侵犯脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致弛緩性肢體麻痹，多見(jiàn)于兒童，故亦稱(chēng)小兒麻痹癥。

4.皰疹性咽峽炎：主要由柯薩奇病毒A組某些血清型引起，典型的癥狀是在軟腭、懸雍垂周?chē)霈F(xiàn)水泡性潰瘍損傷。

5.流行性胸痛：常由柯薩奇病毒B組引起，癥狀為突發(fā)性發(fā)熱和單側(cè)胸痛。

6.心肌炎和心包炎：主要由柯薩奇病毒B組引起。在嬰兒室可引起暴發(fā)性流行，死亡率高。散發(fā)流行于成人和兒童。

7.眼?。河煽滤_奇病毒A組24v型引起急性結(jié)膜炎和EV-D-70型引起的急性出血性結(jié)膜炎。

此外，腸道病毒感染可能還與病毒感染后疲勞綜合征、糖尿病相關(guān)。

（三）本指導(dǎo)原則適用范圍

1.本指導(dǎo)原則適用于利用熒光探針聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）或其他類(lèi)分子生物學(xué)方法，以特定的腸道病毒基因序列為檢測(cè)目標(biāo)，對(duì)來(lái)源于人體樣本中的腸道病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測(cè)，臨床用于輔助診斷手足口病等腸道病毒感染相關(guān)性疾病。涉及其他臨床用途的腸道病毒核酸檢測(cè)試劑可參考本指導(dǎo)原則。手足口病致病病原體中未包含鼻病毒，因此，鼻病毒不在本指南的討論范圍內(nèi)。

2.臨床用于檢測(cè)手足口病致病病原體的檢測(cè)試劑，適用樣本類(lèi)型應(yīng)為鼻咽拭子、咽拭子、糞便/肛拭子、皰疹液、腦脊液（僅限出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例）、血液等。

3.本指導(dǎo)原則適用于腸道病毒通用核酸檢測(cè)試劑、單一病毒種檢測(cè)試劑及單一病毒血清型檢測(cè)試劑。通用檢測(cè)試劑所檢病毒型別應(yīng)至少包括柯薩奇病毒A組的2、4、5、6、7、9、10、12、16型等，B組的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型及?？刹《镜?；針對(duì)柯薩奇病毒核酸檢測(cè)試劑所檢病毒型別應(yīng)至少包括上述A組與B組中的血清型；針對(duì)柯薩奇A組或B組核酸檢測(cè)試劑所檢病毒型別應(yīng)至少包括上述該組所列血清型。針對(duì)埃可病毒核酸檢測(cè)試劑所檢病毒型別應(yīng)至少涵蓋?？刹《?、6、11、14、16、19、25、30等血清型。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及其他等內(nèi)容，其中，與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥應(yīng)重點(diǎn)描述申報(bào)產(chǎn)品所檢測(cè)的腸道病毒型別與臨床適應(yīng)癥的相關(guān)性及相關(guān)腸道病毒在我國(guó)的流行特征；產(chǎn)品描述應(yīng)明確申報(bào)產(chǎn)品所有可檢出的腸道病毒型別、尚未驗(yàn)證的腸道病毒型別；同類(lèi)產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況，應(yīng)著重從所檢病毒型別、不同型別檢測(cè)的最低檢測(cè)限及不同型別間的交叉反應(yīng)等方面寫(xiě)明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。綜述資料的撰寫(xiě)應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料研究資料

此類(lèi)產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、DNA聚合酶、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶（如適用）、核酸分離/純化組分（如有）、試劑盒質(zhì)控品及企業(yè)參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料、質(zhì)控品的確認(rèn)試驗(yàn)資料；生產(chǎn)企業(yè)還應(yīng)提供企業(yè)參考品的原材料選擇、來(lái)源、質(zhì)量指標(biāo)、參考品的制備及陰陽(yáng)性的確認(rèn)過(guò)程等。

1.引物和探針：包括申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)靶序列的引物和探針以及內(nèi)對(duì)照的引物和探針。應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況。針對(duì)檢測(cè)靶序列的引物和探針，建議設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，針對(duì)所有預(yù)期適用的腸道病毒型別進(jìn)行檢出準(zhǔn)確性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，可采用擴(kuò)增靶序列與所有型別腸道病毒基因組比對(duì)研究的方法，最終確認(rèn)最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度檢查、濃度檢查及功能性實(shí)驗(yàn)等。

2.酶：需要的酶主要包括逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：

2.1逆轉(zhuǎn)錄酶應(yīng)包括核酸逆轉(zhuǎn)錄活性、無(wú)核酸內(nèi)切酶活性等。

2.2 DNA聚合酶應(yīng)包括DNA聚合酶活性、無(wú)核酸內(nèi)切酶活性、熱啟動(dòng)能力、熱穩(wěn)定性等。

2.3如申報(bào)產(chǎn)品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，應(yīng)對(duì)其酶活性及熱穩(wěn)定性等質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)定。

3.dNTP：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括純度檢查及功能性實(shí)驗(yàn)等。

4.核酸分離/純化組分（如有）的原理介紹、主要組成、主要原材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)驗(yàn)證資料。

5.試劑盒質(zhì)控品

試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒質(zhì)控品來(lái)實(shí)現(xiàn)，針對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品申請(qǐng)人應(yīng)明確質(zhì)控品的來(lái)源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控品陰陽(yáng)性的確認(rèn)方法及相關(guān)驗(yàn)證資料。申報(bào)產(chǎn)品的質(zhì)控體系應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：

5.1陽(yáng)性質(zhì)控品中應(yīng)含有天然的或人工合成的包含試劑盒所檢測(cè)靶序列的RNA，至少應(yīng)包含臨床較常見(jiàn)的血清型。質(zhì)控品應(yīng)參與樣本處理和檢測(cè)的全過(guò)程，如核酸的平行提取等步驟。企業(yè)應(yīng)對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果（如Ct值）做出明確的范圍要求。

5.2陰性質(zhì)控品應(yīng)不含試劑盒所檢測(cè)靶序列的RNA，質(zhì)控品應(yīng)參與樣本處理和檢測(cè)的全過(guò)程，如核酸的平行提取等步驟，以對(duì)可能存在的交叉污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

5.3內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針設(shè)計(jì)和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線(xiàn)又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。對(duì)內(nèi)對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果（如Ct值）亦應(yīng)做出明確的范圍要求。

6.企業(yè)參考品：應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明有關(guān)企業(yè)參考品的原料選擇、制備、陰陽(yáng)性確認(rèn)等試驗(yàn)。

企業(yè)參考品的核酸性質(zhì)應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期檢測(cè)的靶物質(zhì)一致。鑒于腸道病毒為RNA病毒，企業(yè)參考品可采用滅活病毒、含有腸道病毒基因組的裝甲病毒（或假病毒）、人工克隆或合成的腸道病毒基因組RNA。具體要求如下：

6.1陽(yáng)性參考品和陰性參考品

陽(yáng)性參考品應(yīng)包含本指南范圍中規(guī)定申報(bào)產(chǎn)品至少應(yīng)檢出的腸道病毒血清型，例如，腸道病毒通用型檢測(cè)試劑陽(yáng)性參考品應(yīng)至少包含柯薩奇病毒A組的2、4、5、6、7、9、10、12、16型等，B組的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型及?？刹《镜?，其他單一病毒種及單一病毒血清型檢測(cè)試劑陽(yáng)性參考品應(yīng)包含該類(lèi)產(chǎn)品至少應(yīng)檢出的血清型。陰性參考品應(yīng)考慮檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià)，應(yīng)納入不在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的其他腸道病毒血清型樣品（如有）和其他病原體樣品。

6.2檢測(cè)限參考品

申請(qǐng)人應(yīng)明確檢測(cè)限參考品中病毒核酸濃度的確定方法，明確檢測(cè)限參考品中病毒核酸濃度的確定依據(jù)，檢測(cè)限參考品中腸道病毒核酸濃度應(yīng)為申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)限濃度或略高于檢測(cè)限濃度，檢測(cè)限參考品應(yīng)包含申報(bào)產(chǎn)品至少應(yīng)檢出的腸道病毒血清型。

6.3精密度參考品

可不包含所有涉及的腸道病毒血清型，但應(yīng)選擇多個(gè)臨床較常見(jiàn)的型別，針對(duì)所選型別應(yīng)分別至少設(shè)置一個(gè)弱陽(yáng)性水平。

若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，并提交生產(chǎn)工藝驗(yàn)證報(bào)告；如主要原材料購(gòu)自其他供應(yīng)商，則需針對(duì)供應(yīng)商的選擇提供評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，并提供供應(yīng)商出具的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告以及申請(qǐng)人對(duì)該原材料進(jìn)行的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可以圖表方式表示，并說(shuō)明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設(shè)置，提供相關(guān)的研究資料。

4.確定最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。

5.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

6.如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)提交產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能評(píng)價(jià)的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、試驗(yàn)方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來(lái)源等。

針對(duì)不同的樣本類(lèi)型，申請(qǐng)人應(yīng)分別完成性能評(píng)估，包括陰陽(yáng)性符合率、最低檢測(cè)限、精密度、分析特異性等。

分析性能評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法可以參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。對(duì)于此類(lèi)產(chǎn)品，性能評(píng)估中所用樣品（除非特別說(shuō)明）可參考上述企業(yè)參考品的制備要求。各項(xiàng)性能評(píng)價(jià)應(yīng)符合以下要求。

1.核酸分離/純化性能

在進(jìn)行靶核酸檢測(cè)前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂岱蛛x/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測(cè)試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測(cè)試劑的特性，對(duì)配合使用的核酸分離/純化試劑的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗(yàn)證，提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

2.申請(qǐng)人應(yīng)明確申報(bào)產(chǎn)品所能檢出所有腸道病毒血清型及不能檢出的血清型。建議申請(qǐng)人采用申報(bào)產(chǎn)品對(duì)目前已知所有腸道病毒血清型樣本進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證申報(bào)產(chǎn)品所檢血清型范圍，用于驗(yàn)證的樣本可以為臨床收集樣本、病毒基因組或人工構(gòu)建假病毒。

3.陽(yáng)性/陰性參考品符合率

陽(yáng)性參考品的檢測(cè)旨在驗(yàn)證試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的各腸道病毒血清型均可以在適當(dāng)?shù)臐舛缺粰z測(cè)到，陽(yáng)性參考品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。陰性參考品旨在評(píng)價(jià)試劑特異性，陰性參考品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。

4.最低檢測(cè)限

申報(bào)產(chǎn)品最低檢測(cè)限的性能評(píng)估資料應(yīng)包含最低檢測(cè)限的確定及驗(yàn)證過(guò)程。

4.1應(yīng)針對(duì)申報(bào)產(chǎn)品所能檢出的CA16、CA6、EV71等常見(jiàn)腸道病毒血清型分別進(jìn)行確定，建議采用培養(yǎng)后病毒原液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)渲葡盗邢♂尩臉悠愤M(jìn)行最低檢測(cè)限的評(píng)價(jià)，系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可通過(guò)概率計(jì)算或其他適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)算選取適當(dāng)檢出率水平的濃度作為最低檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)，如95%（n≥20）的陽(yáng)性檢出率水平。病毒原液濃度測(cè)定建議采用空斑試驗(yàn)，濃度水平采用空斑形成單位（PFU）為計(jì)量單位。

4.2應(yīng)選擇申報(bào)產(chǎn)品最低檢測(cè)限或接近最低檢測(cè)限的病毒水平對(duì)申報(bào)產(chǎn)品最低檢測(cè)限進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證最低檢測(cè)限的樣本應(yīng)至少包含申報(bào)產(chǎn)品所能檢出的CA16、CA6、EV71等常見(jiàn)腸道病毒血清型，應(yīng)至少選擇多個(gè)病毒株進(jìn)行驗(yàn)證。企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢測(cè)限驗(yàn)證的各個(gè)病毒株的來(lái)源、型別及濃度水平（PFU）確認(rèn)試驗(yàn)等信息。

4.3申請(qǐng)人應(yīng)明確申報(bào)產(chǎn)品最低可檢出的腸道病毒基因拷貝數(shù)水平，同時(shí)提供確定過(guò)程及相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本項(xiàng)研究應(yīng)針對(duì)不同血清型分別確認(rèn)，所用樣本血清型應(yīng)包括申報(bào)產(chǎn)品最低檢測(cè)限參考品設(shè)置的血清型。

4.4申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)企業(yè)最低檢測(cè)限參考品，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)滿(mǎn)足相應(yīng)要求。

5.分析特異性

5.1交叉反應(yīng)

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)可能出現(xiàn)在檢測(cè)樣本中的病原體進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的樣品，除腸道病毒外，其他病原體應(yīng)盡量采用滅活病原體培養(yǎng)物或臨床樣本。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證，申請(qǐng)人應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明交叉反應(yīng)樣本來(lái)源、病原體鑒定和滴度確定的方法和結(jié)果。病原體種類(lèi)主要考慮以下幾方面：試劑盒檢測(cè)范圍以外的其他腸道病毒血清型、樣本中可能出現(xiàn)的其他病原體。建議對(duì)以下病原體進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證：諾如病毒、單純皰疹病毒1/2型、腸道腺病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、輪狀病毒、甲型肝炎病毒、星狀病毒、EB病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒、甲型流感病毒、副流感病毒、乙型流感病毒、巨細(xì)胞病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、戊肝病毒、B族鏈球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀菌、弧菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、草綠色鏈球菌、奈瑟菌屬、黏液羅氏菌、變形桿菌等。

5.2干擾試驗(yàn)

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類(lèi)型，針對(duì)可能存在的干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)，并針對(duì)有代表性的腸道病毒血清型，至少在病毒臨界陽(yáng)性水平進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證。干擾物質(zhì)的選取應(yīng)至少包括：血紅蛋白、黃疸（僅限血液樣本）、脂血（僅限血液樣本）、白細(xì)胞、粘蛋白、常見(jiàn)病毒治療藥物、抗生素、微生態(tài)制劑、糞便中未消化的食物纖維等。

6.精密度

企業(yè)應(yīng)對(duì)申報(bào)產(chǎn)品精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。因模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來(lái)的所有變異因素，因此精密度評(píng)價(jià)中所用樣本應(yīng)至少包含精密度參考品及若干臨床樣本，且精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。針對(duì)本類(lèi)產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求：

6.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)分析儀、操作者、試驗(yàn)地點(diǎn)、檢測(cè)批次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

6.2設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天的檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

6.3用于精密度評(píng)價(jià)的臨床樣本均應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣品、臨界陽(yáng)性樣品、（中或強(qiáng)）陽(yáng)性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，臨床樣本精密度評(píng)價(jià)中的每一次檢測(cè)均應(yīng)從核酸提取開(kāi)始。

（五）陽(yáng)性判斷值確定資料

對(duì)于此類(lèi)試劑，陽(yáng)性判斷值即為能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cutoff），對(duì)于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)的方式進(jìn)行相關(guān)研究。申請(qǐng)人可選取適當(dāng)?shù)呐R床樣本進(jìn)行試驗(yàn)以確定陽(yáng)性判斷值。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開(kāi)瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行全性能的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類(lèi)型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

對(duì)于樣本提取后不能立即進(jìn)行檢測(cè)的，應(yīng)明確核酸儲(chǔ)存條件、儲(chǔ)存時(shí)間等，同時(shí)應(yīng)提供相應(yīng)的核酸穩(wěn)定性研究資料。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性?xún)刹糠謨?nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說(shuō)明書(shū)【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

（七）臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)的開(kāi)展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫(xiě)等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求。

1.研究方法

對(duì)于已有同類(lèi)產(chǎn)品上市的試劑的臨床研究，選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類(lèi)產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報(bào)產(chǎn)品（以下稱(chēng)考核試劑）與之進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。另外，申請(qǐng)人還應(yīng)選擇不少于30例核酸檢測(cè)陽(yáng)性的新鮮采集樣本進(jìn)行考核試劑與腸道病毒感染檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法—病毒分離培養(yǎng)鑒定方法或其他證明腸道病毒感染的方法進(jìn)行比較研究。如醫(yī)院無(wú)病毒培養(yǎng)條件，可由該醫(yī)院委托其他具有相應(yīng)條件的機(jī)構(gòu)進(jìn)行。

對(duì)于無(wú)法選擇參比試劑的新型腸道病毒核酸檢測(cè)試劑，其臨床研究應(yīng)選擇病毒分離培養(yǎng)鑒定和/或病毒核酸序列測(cè)定方法作為參比方法。用于核酸序列測(cè)定的引物序列應(yīng)不同于考核試劑中用于檢測(cè)目的基因的引物序列。

臨床試驗(yàn)中如涉及核酸序列測(cè)定方法，則建議對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行雙向測(cè)序。應(yīng)在臨床研究報(bào)告中對(duì)選用的測(cè)序方法做詳細(xì)介紹，并提供以下關(guān)于測(cè)序試驗(yàn)的詳細(xì)信息及資料：

1.1測(cè)序方法原理、測(cè)序儀型號(hào)、測(cè)序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

1.2測(cè)序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇、分子量、純度、功能性試驗(yàn)等資料。

1.3對(duì)所選測(cè)序方法的分析性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是最低檢測(cè)限的確認(rèn)，建議將所選測(cè)序方法與擬申報(bào)產(chǎn)品的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對(duì)分析。

1.4測(cè)序方法應(yīng)建立合理的陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.5提交有代表性的樣本測(cè)序圖譜及結(jié)果分析資料。

2.臨床試驗(yàn)病例數(shù)

申報(bào)產(chǎn)品臨床試驗(yàn)總病例數(shù)應(yīng)不低于500例。入組樣本的血清型應(yīng)滿(mǎn)足如下要求，腸道病毒通用型檢測(cè)試劑陽(yáng)性樣本應(yīng)至少包含柯薩奇病毒A組的2、4、5、6、10、12、16型等，B組的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型及?？刹《镜龋渌麊我徊《痉N及單一病毒血清型檢測(cè)試劑陽(yáng)性樣本應(yīng)包含該類(lèi)產(chǎn)品至少應(yīng)檢出的血清型；上述血清型中常見(jiàn)血清型應(yīng)包括該型別中不同的基因型，常見(jiàn)血清型陽(yáng)性病例數(shù)單獨(dú)統(tǒng)計(jì)應(yīng)滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。單一病毒血清型檢測(cè)試劑，臨床試驗(yàn)中其檢測(cè)的血清型應(yīng)包括該型別中不同的基因型，陽(yáng)性病例數(shù)應(yīng)滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

另外，對(duì)于已被批準(zhǔn)上市的腸道病毒核酸（通用型）檢測(cè)試劑，如果在其注冊(cè)證有效期內(nèi)出現(xiàn)了新型腸道病毒的暴發(fā)流行，如有需要，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)迅速針對(duì)新型腸道病毒開(kāi)展臨床比對(duì)研究，可以采用病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或當(dāng)時(shí)衛(wèi)生行政部門(mén)認(rèn)可的針對(duì)該新型腸道病毒血清型的診斷標(biāo)準(zhǔn)作為參比方法進(jìn)行臨床比對(duì)研究，分別對(duì)采集自新型腸道病毒感染（陽(yáng)性病例不少于30例）、其他常見(jiàn)的腸道病毒及非腸道病毒感染但具有相應(yīng)癥狀的患者的新鮮樣本進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)研究，總例數(shù)不少于200例，如臨床試驗(yàn)研究結(jié)果可以證明其對(duì)新型腸道病毒的檢測(cè)能力，申請(qǐng)人應(yīng)考慮產(chǎn)品預(yù)期用途發(fā)生的改變，同時(shí)提出變更申請(qǐng)，并按相關(guān)法規(guī)要求提交分析性能評(píng)估和臨床試驗(yàn)研究等資料。

3.臨床研究單位的選擇

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開(kāi)展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇應(yīng)盡量考慮擬申報(bào)產(chǎn)品的特點(diǎn)和預(yù)期用途，綜合流行病學(xué)背景，受試者的選擇具有一定的地域代表性。且臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉評(píng)價(jià)方案。

4.病例選擇及樣本類(lèi)型

臨床試驗(yàn)應(yīng)選擇具有相應(yīng)腸道病毒感染癥狀/體征或有密切接觸史的人群作為研究對(duì)象。申請(qǐng)人在建立病例納入標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)考慮到試劑所適用的各年齡段人群的差異。臨床試驗(yàn)入組病例應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期用途中適用人群一致。

臨床試驗(yàn)中所涉及的樣本類(lèi)型應(yīng)為實(shí)際臨床檢測(cè)中常用的樣本類(lèi)型。如申報(bào)產(chǎn)品所適用的樣本類(lèi)型同時(shí)包含鼻咽拭子、咽拭子、糞便/肛拭子、皰疹液、腦脊液或血液等多個(gè)樣本類(lèi)型，應(yīng)針對(duì)不同樣本類(lèi)型分別進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

5.倫理學(xué)要求

臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則，必須獲得臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的同意。研究者應(yīng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者的風(fēng)險(xiǎn)性，應(yīng)提交倫理委員會(huì)的審查意見(jiàn)。

6.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑及所用機(jī)型應(yīng)一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，考核試劑的樣本類(lèi)型不應(yīng)超越參比試劑對(duì)樣本類(lèi)型的檢測(cè)要求，如果選擇了參比試劑適用樣本類(lèi)型以外的樣本，則應(yīng)選擇病毒分離培養(yǎng)鑒定或其他合理方法對(duì)額外的樣本類(lèi)型進(jìn)行驗(yàn)證。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如檢測(cè)結(jié)果一致性分析、陰性/陽(yáng)性符合率等。對(duì)于本類(lèi)產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn)的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評(píng)價(jià)考核試劑與參比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。

在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的第三種同類(lèi)試劑進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

8.質(zhì)量控制

臨床試驗(yàn)開(kāi)始前，應(yīng)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

9.臨床試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告撰寫(xiě)

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建議在臨床總結(jié)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

9.1臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述

9.1.1臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹。

9.1.2病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)、樣本編盲和揭盲的操作流程等。

9.1.3樣本類(lèi)型，樣本的收集、處理及保存等。

9.1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

9.2具體的臨床試驗(yàn)情況

9.2.1臨床試驗(yàn)所用體外診斷試劑及儀器的名稱(chēng)、批號(hào)、機(jī)型等信息。

9.2.2對(duì)各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況、不同血清型分布情況進(jìn)行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組和各種血清型的樣本例數(shù)。

9.2.3質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控品運(yùn)行情況。

9.2.4具體試驗(yàn)過(guò)程，樣本收集、樣本保存、樣本檢測(cè)、結(jié)果處理、結(jié)果不一致樣本的確認(rèn)等。

9.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

9.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測(cè)或第三方驗(yàn)證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對(duì)異常值或缺失值的處理、研究過(guò)程中是否涉及對(duì)方案的修改。

9.3.2結(jié)果的一致性分析

計(jì)算陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率，采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如四格表卡方檢驗(yàn)或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

9.4討論和結(jié)論

對(duì)總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡(jiǎn)要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床研究有無(wú)特別說(shuō)明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請(qǐng)人產(chǎn)品研制、臨床評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫(xiě)產(chǎn)品技術(shù)要求。

腸道病毒核酸檢測(cè)試劑的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)主要包括：物理性狀、陰/陽(yáng)性參考品符合率、精密度、最低檢測(cè)限等。陽(yáng)性參考品主要考察對(duì)試劑盒適用范圍內(nèi)不同血清型腸道病毒的檢測(cè)能力，陰性參考品則重點(diǎn)對(duì)申報(bào)試劑的分析特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

如果申報(bào)試劑已有適用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請(qǐng)人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測(cè)要求。

按照《辦法》的規(guī)定，此類(lèi)產(chǎn)品為第三類(lèi)體外診斷試劑，申請(qǐng)人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫(xiě)規(guī)范的要求。

（九）產(chǎn)品注冊(cè)檢驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)《辦法》的要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類(lèi)體外診斷試劑產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢驗(yàn)。對(duì)于已經(jīng)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品的檢測(cè)項(xiàng)目，在注冊(cè)檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品進(jìn)行注冊(cè)檢驗(yàn)，對(duì)于目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的、參考品的項(xiàng)目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的企業(yè)參考品。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)腸道病毒核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地完成說(shuō)明書(shū)編制。

1.【預(yù)期用途】

1.1試劑盒用于定性檢測(cè)人鼻咽拭子、咽拭子、糞便/肛拭子、皰疹液、腦脊液或其他樣本的腸道病毒核酸，適用樣本類(lèi)型應(yīng)結(jié)合實(shí)際的臨床研究完成情況進(jìn)行確認(rèn)。

1.2明確腸道病毒核酸試劑的臨床意義，主要用于對(duì)腸道病毒感染引起的手足口病等的輔助診斷，以便于臨床醫(yī)生結(jié)合病人的其他檢查結(jié)果進(jìn)行更加準(zhǔn)確的疾病判斷和科學(xué)的患者管理，應(yīng)對(duì)腸道病毒感染引起的相應(yīng)臨床癥狀進(jìn)行描述。

1.3簡(jiǎn)單介紹待測(cè)目標(biāo)的特征，如病毒種系淵源、生物學(xué)性狀、宿主特性、致病性、感染后臨床表現(xiàn)、待測(cè)靶基因特征等。

1.4待測(cè)人群特征介紹：具有腸道病毒感染癥狀的患者、相關(guān)的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等，待測(cè)人群應(yīng)與申報(bào)產(chǎn)品臨床試驗(yàn)中入組人群一致。

1.5應(yīng)明確申報(bào)產(chǎn)品所能檢測(cè)病毒血清型及經(jīng)過(guò)臨床驗(yàn)證的血清型。

1.6應(yīng)強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過(guò)基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序。

2.【檢驗(yàn)原理】

詳細(xì)說(shuō)明試劑盒技術(shù)原理，及核酸分離/純化方法、原理。說(shuō)明檢測(cè)的靶基因座位、序列長(zhǎng)度等；介紹引物及探針設(shè)計(jì)、不同樣品反應(yīng)體系（管）組合、對(duì)照品（質(zhì)控品）設(shè)置及熒光信號(hào)標(biāo)記等。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成分】

詳細(xì)說(shuō)明試劑盒內(nèi)各組分的名稱(chēng)、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說(shuō)明其生物學(xué)來(lái)源、活性及其他特性；說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱(chēng)、貨號(hào)以及醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)/備案號(hào)（如有）等詳細(xì)信息。當(dāng)試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時(shí)，應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)與相應(yīng)的穩(wěn)定性研究結(jié)論一致。

5.【適用儀器】

所有適用的儀器型號(hào)，提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶(hù)操作。

6.【樣本要求】 

明確適用的樣本類(lèi)型。并詳細(xì)描述樣本采集及預(yù)處理要求、運(yùn)輸要求、保存條件及期限等。特別是樣本采集所需設(shè)備及保存液，需特別明確供應(yīng)商、貨號(hào)及注冊(cè)證號(hào)/備案號(hào)（如有）。有關(guān)描述均應(yīng)建立在相關(guān)性能評(píng)價(jià)及穩(wěn)定性研究的基礎(chǔ)上。

樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項(xiàng)。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)。對(duì)照品（質(zhì)控品）參與樣本核酸的平行提取的要求等。

7.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項(xiàng)等。

7.4逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的溫度和時(shí)間設(shè)置、PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測(cè)基因、內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇等。

7.6質(zhì)量控制：說(shuō)明對(duì)照品（質(zhì)控品）的檢測(cè)要求。

8.【陽(yáng)性判斷值】

簡(jiǎn)要總結(jié)陽(yáng)性判斷值研究方法及結(jié)論。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合對(duì)照品（質(zhì)控品）以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。檢驗(yàn)結(jié)果的解釋?xiě)?yīng)以陽(yáng)性判斷值的研究結(jié)論為依據(jù)。如有適用的臨床診療或篩查指南，則應(yīng)在此項(xiàng)下引用，相應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果的解釋?xiě)?yīng)符合相關(guān)指南的要求。

10.【檢驗(yàn)方法的局限性】

應(yīng)至少包括如下描述：

10.1本試劑檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀及其他相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，不得單獨(dú)作為患者管理的依據(jù)。

10.2針對(duì)腸道病毒通用型檢測(cè)試劑，未包含在申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)型別范圍內(nèi)的腸道病毒血清型。

10.3不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理以及不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。

10.4針對(duì)腸道病毒通用型核酸檢測(cè)試劑，應(yīng)明確申報(bào)產(chǎn)品所檢病毒血清型中經(jīng)過(guò)臨床驗(yàn)證的型別，明確其余型別未經(jīng)臨床驗(yàn)證。

10.5申報(bào)產(chǎn)品應(yīng)明確不同病程不同階段樣本的陽(yáng)性率不一致。

10.6取標(biāo)本期間，接種減毒活疫苗的患者可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述以下性能指標(biāo)：

11.1對(duì)相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品（如有）檢測(cè)的符合情況。

11.2最低檢測(cè)限：依據(jù)分析性能評(píng)估資料，說(shuō)明產(chǎn)品最低檢限，并簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法。

11.3企業(yè)內(nèi)部陽(yáng)性/陰性參考品符合率，陽(yáng)性/陰性參考品的組成、來(lái)源、濃度梯度設(shè)置以及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等信息。

11.4精密度：建議詳細(xì)描述針對(duì)不同腸道病毒基因型，采用不同來(lái)源的樣本（如人工模擬樣本和臨床樣本）在各個(gè)濃度水平進(jìn)行的精密度評(píng)價(jià)結(jié)果，可采用列表形式描述。

11.5分析特異性：建議以列表方式說(shuō)明驗(yàn)證的其他腸道病毒血清型、相關(guān)病原體等的交叉反應(yīng)性及其驗(yàn)證濃度水平。總結(jié)潛在干擾物質(zhì)的評(píng)價(jià)濃度水平及干擾情況。

11.6簡(jiǎn)要描述臨床試驗(yàn)的基本信息、試驗(yàn)方法和結(jié)論。

12.【注意事項(xiàng)】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出生物安全性的警告。

12.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

12.3強(qiáng)調(diào)產(chǎn)品性能僅針對(duì)聲稱(chēng)的適用樣本類(lèi)型及【樣本要求】項(xiàng)下說(shuō)明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進(jìn)行了驗(yàn)證，其他樣本類(lèi)型或樣本采集、處理方法不能保證產(chǎn)品性能。

三、名詞解釋

1.PCR-熒光探針?lè)?/p>

在PCR過(guò)程中利用熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，并通過(guò)對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的PCR。

四、起草單位

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。