附件：乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（2023年修訂版）（2024年第1號）.doc

乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸檢測試劑注冊
審查指導(dǎo)原則（2023年修訂版）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)檢測試劑注冊申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。如申請人認(rèn)為有必要增加本指導(dǎo)原則不包含的研究內(nèi)容，可自行補(bǔ)充。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

HBV DNA定量檢測試劑是指利用包括實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）或其他的分子生物學(xué)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以HBV基因序列為檢測靶標(biāo)，對人血清、血漿及其他人體樣本中的HBV DNA進(jìn)行體外定量檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，可作為乙型肝炎輔助診斷的指標(biāo)之一，還可通過對血液中HBV DNA濃度的檢測可用于HBV感染的輔助診斷、治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷。

本指導(dǎo)原則適用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法的HBV DNA定量檢測試劑的治療監(jiān)測用途，定性及其他類同用途的核酸定量檢測方法可參照本指導(dǎo)原則，但應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內(nèi)容是否適用。如不適用，應(yīng)另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評價(jià)方法。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊申報(bào)和相關(guān)變更注冊。

本指導(dǎo)原則不適用于國家法定血源篩查用HBV DNA檢測試劑。

二、注冊審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如乙型肝炎病毒DNA檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。提供不同適用機(jī)型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數(shù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣犹崛》绞綉?yīng)分別明確）和PCR擴(kuò)增的時(shí)間，以及檢測全過程所需的時(shí)間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時(shí)間。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶標(biāo)，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。應(yīng)著重從方法學(xué)及檢出限等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

乙型肝炎病毒DNA檢測試劑已有國家標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求，并使用國家標(biāo)準(zhǔn)品對三批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)。

乙型肝炎病毒DNA檢測試劑的檢出限水平應(yīng)符合國家相關(guān)指南文件規(guī)定，申報(bào)產(chǎn)品對國家最低檢出量參考品的檢測結(jié)果應(yīng)與聲稱的檢出限水平相當(dāng)。

如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

如申報(bào)產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要提交采用不同機(jī)型進(jìn)行性能評估的資料。如申報(bào)產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗(yàn)證。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的乙型肝炎病毒陽性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽性和濃度水平，提交具體的試驗(yàn)資料。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實(shí)樣本，如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)粒進(jìn)行分析性能評估。對于各項(xiàng)性能中采用的樣本，在下述各項(xiàng)性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

2.1樣本穩(wěn)定性

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行詳細(xì)研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段即對儲存樣本進(jìn)行性能驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價(jià)

如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

2.2適用的樣本類型

列明產(chǎn)品適用的樣本類型。應(yīng)提交對不同樣本類型一致性的驗(yàn)證，包括不同抗凝劑、采血管的驗(yàn)證或要求。

2.3正確度

對測量正確度的評價(jià)依次包括：與國家參考品（和/或國際參考品）的比對研究、回收試驗(yàn)、方法學(xué)比對等方法，企業(yè)可根據(jù)實(shí)際情況選擇合理方法進(jìn)行研究。

 2.3.1國家/國際參考品驗(yàn)證

此類檢測試劑有相應(yīng)的國家/國際參考品，應(yīng)使用國家/國際參考品對試劑進(jìn)行驗(yàn)證，重點(diǎn)觀察對相應(yīng)參考品檢測結(jié)果的符合情況。

2.3.2方法學(xué)比對

采用參考方法或國內(nèi)/國際普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類試劑作為對比方法，與擬申報(bào)試劑同時(shí)檢測一批臨床樣本，從測定結(jié)果間的相關(guān)性了解擬申報(bào)試劑與參比方法間的一致情況。如顯著相關(guān)，說明兩檢測系統(tǒng)對臨床樣本測定結(jié)果基本相符，對同一份臨床樣本的醫(yī)學(xué)解釋，擬申報(bào)試劑與對比方法相比不會產(chǎn)生顯著差異結(jié)果。
    在實(shí)施方法學(xué)比對前，應(yīng)分別對擬申報(bào)試劑和對比試劑進(jìn)行初步評估，只有在確認(rèn)兩者都分別符合各自相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方可進(jìn)行比對試驗(yàn)。方法學(xué)比對時(shí)應(yīng)注意質(zhì)量控制、樣本類型、濃度分布范圍并對結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3.3回收試驗(yàn)。用于評估定量檢測方法準(zhǔn)確測定加入純分析物的能力，結(jié)果用回收率表示。通常對樣本進(jìn)行3～5次回收試驗(yàn)，取平均值即平均回收率。

回收試驗(yàn)注意事項(xiàng)：

2.3.3.1加入的標(biāo)準(zhǔn)液體積一般應(yīng)小于樣本體積的10%；

2.3.3.2盡量使加入標(biāo)準(zhǔn)液后樣本中的被測物濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平；

2.3.3.3標(biāo)準(zhǔn)物的濃度應(yīng)該足夠高，以得到不同濃度的回收樣本；

2.3.3.4注意基質(zhì)效應(yīng)，盡量采用與臨床待測樣本一致的基質(zhì)。

2.4企業(yè)參考品驗(yàn)證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.5精密度

應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評價(jià)。精密度評價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價(jià)周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度、實(shí)驗(yàn)室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

采用臨床樣本進(jìn)行精密度評價(jià)，應(yīng)至少包含4個(gè)水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、弱陽性樣本、強(qiáng)陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅纾?/p>

陰性樣本：不含乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）的樣本，不得檢出陽性（n≥20）。

臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢出限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。

弱陽性樣本：待測物濃度呈弱陽性（高于定量限濃度1個(gè)數(shù)量級附近），陽性檢出率為100%且變異系數(shù)（CV）符合標(biāo)準(zhǔn)要求（n≥20）。

強(qiáng)陽性樣本：待測物濃度呈中度至強(qiáng)陽性，陽性檢出率為100%且變異系數(shù)（CV）符合標(biāo)準(zhǔn)要求（n≥20）。

2.6 檢出限

2.6.1最低檢出限與定量限的確定

建議使用國際參考品/國家參考品進(jìn)行梯度稀釋并多次檢測，將具有95%以上陽性檢出率的病毒水平作為最低檢出限。定量限應(yīng)高于或等于檢出限，將多次（至少10次）測量的結(jié)果符合試劑正確度要求的最低病毒水平作為定量限。

2.6.2最低檢出限和定量限的驗(yàn)證

申報(bào)試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度對不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行驗(yàn)證，每個(gè)型別至少采用5個(gè)樣本。

定量限的驗(yàn)證應(yīng)對不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行驗(yàn)證。

企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限/定量限驗(yàn)證的各個(gè)病毒株的來源、型別確認(rèn)及滴度確認(rèn)試驗(yàn)等信息。

2.7.線性范圍

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本（由可溯源至國家參考品/國際參考品的方法定量）進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用經(jīng)確認(rèn)為陰性的混合人血清或血漿，應(yīng)包含不少于9個(gè)濃度（應(yīng)包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個(gè)批次的試劑進(jìn)行試驗(yàn)。通過評價(jià)一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的正確度確定該產(chǎn)品的線性范圍。

2.8包容性：HBV不同基因型的覆蓋

應(yīng)對乙肝病毒不同基因型的樣本進(jìn)行檢測，重點(diǎn)考察各基因型病毒樣本的檢出限及重復(fù)性指標(biāo)，每個(gè)基因型的病毒樣本稀釋成3個(gè)濃度水平，對每水平樣本進(jìn)行重復(fù)測定。

注意包容性研究樣本和檢出限研究樣本不能重復(fù)。

2.9分析特異性

2.9.1交叉反應(yīng)

用于HBV DNA檢測試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類見表1）。

建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 cfu/ml或更高，病毒為105 pfu/ml或更高。

申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

2.9.2干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（見表2）和常用的治療藥物如普通IFNα（2a、2b和1b）和聚乙二醇干擾素α（2a和2b）[PegIFNα（2a和2b）]、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）、恩替卡韋（entecavir）、替比夫定（telbivudine）等。

使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證，另外，亦建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(最差條件)條件下進(jìn)行評價(jià)。對于常見藥物干擾試驗(yàn)，建議參照相應(yīng)藥物藥代動力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗(yàn)證。

建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測。

2.10溯源性

應(yīng)提交詳細(xì)的溯源性研究資料。企業(yè)制備的企業(yè)內(nèi)部參考品、二級參考品、用于制備商品化校準(zhǔn)品的儲備液以及不同基因型的陽性樣本均應(yīng)能夠溯源至國家參考品/國際參考品。使用國家參考品/國際參考品為校準(zhǔn)品，應(yīng)用多臺儀器對企業(yè)一級參考品進(jìn)行校準(zhǔn)，以下逐級對企業(yè)二級參考品、校準(zhǔn)儲備液、陽性參考品進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.11核酸提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸（DNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗(yàn)證。

2.12 反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。

提交不同適用機(jī)型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

3.穩(wěn)定性研究

申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4.陽性判斷值研究

對于此類試劑，正常人群中不應(yīng)檢出HBV DNA，參考值確定資料主要是指Ct的確認(rèn)資料，申請人可采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報(bào)產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時(shí)間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。提交所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機(jī)構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。

提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗(yàn)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗(yàn)等方式，對病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價(jià)，其中序列比對包括與已公布病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗(yàn)等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價(jià)和驗(yàn)證。

5.1.4質(zhì)控品

HBV DNA定量檢測試劑的質(zhì)控品應(yīng)至少設(shè)置三個(gè)量級水平的系列質(zhì)控品：臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。校準(zhǔn)品和質(zhì)控品均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對整個(gè)PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對各種質(zhì)控品結(jié)果做出明確的范圍要求。

5.1.5內(nèi)標(biāo)

樣本反應(yīng)管應(yīng)設(shè)置合理的內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以對管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。申請人應(yīng)對內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線，但又不能對目的基因的檢測造成競爭性抑制而導(dǎo)致假陰性，對內(nèi)標(biāo)的結(jié)果應(yīng)有明確的范圍要求。

5.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品建議采用臨床樣本，不宜使用質(zhì)粒。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品：應(yīng)包含不同基因型別，陽性參考品的亞型以及濃度需經(jīng)過可靠方法進(jìn)行確認(rèn)。

陰性參考品：可采用經(jīng)確認(rèn)無HBV感染的臨床樣本，還應(yīng)考慮對交叉反應(yīng)的驗(yàn)證，納入其他近似病原體感染樣本。

檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平，應(yīng)明確參考品中靶核酸的濃度水平。

重復(fù)性參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。如有必要，建議同時(shí)設(shè)置陰性參考品進(jìn)行驗(yàn)證。

線性參考品：建議濃度設(shè)置盡量覆蓋線性范圍，濃度間隔均勻。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。

（四）臨床試驗(yàn)研究

1.研究方法

對于該類試劑已有同類產(chǎn)品上市，按照法規(guī)要求選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用擬申報(bào)產(chǎn)品（以下稱試驗(yàn)體外診斷試劑）與之進(jìn)行對比試驗(yàn)研究，證明試驗(yàn)體外診斷試劑與已上市產(chǎn)品一致性。對比試劑在預(yù)期用途、適用人群、樣本類型、檢測方法學(xué)、檢測性能等方面應(yīng)與試驗(yàn)體外診斷試劑具有較好的可比性。

2.臨床研究單位的選擇

建議申辦者在選擇臨床研究單位時(shí)，應(yīng)考慮到各試驗(yàn)單位的代表性，臨床研究單位應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，試驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價(jià)方案。在整個(gè)試驗(yàn)中，試驗(yàn)體外診斷試劑和對比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)執(zhí)行同一臨床試驗(yàn)方案，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申辦者的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程，特別是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的受試者入組/排除標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)中剔除的受試者應(yīng)在臨床試驗(yàn)小結(jié)和報(bào)告中詳細(xì)列出，并說明理由。

4.受試者選擇及樣本類型

對于定量檢測，應(yīng)針對主要評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行樣本量估算。臨床試驗(yàn)方案中建議同時(shí)給出與所選定評價(jià)指標(biāo)對應(yīng)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，并提供確定依據(jù)。入組樣本應(yīng)在線性范圍內(nèi)的各個(gè)濃度水平均應(yīng)有一定量的樣本例數(shù)，并著重考慮對醫(yī)學(xué)決定水平的檢測性能進(jìn)行充分驗(yàn)證。

建議臨床試驗(yàn)應(yīng)樣本數(shù)不少于500例，其中應(yīng)主要選擇乙型肝炎患者樣本（陽性樣本），不少于450例。在受試者選擇時(shí)應(yīng)考慮到地域性的差別，應(yīng)涵蓋不少于10例D基因型，應(yīng)注重不同藥物治療的乙型肝炎患者。陽性樣本應(yīng)覆蓋試劑線性范圍，高、中、低值均有一定量的分布。建議選擇不少于50例的陰性樣本進(jìn)行比對試驗(yàn)，陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應(yīng)情況，應(yīng)選擇其他類肝炎病毒感染、其他良性或惡性肝臟疾病患者，以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗(yàn)中所涉及的樣本類型應(yīng)為實(shí)際臨床檢測中常用的樣本類型。對于同時(shí)能夠檢測血清和血漿樣本的試劑，如臨床前研究證明分析性能沒有差異，臨床試驗(yàn)中可進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)。    

臨床研究應(yīng)以新鮮樣本為主，如采用既往樣本應(yīng)另行說明 。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，定量檢測的體外診斷試劑臨床試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)通常包括回歸分析的回歸系數(shù)、截距、相關(guān)系數(shù)和決定系數(shù)等。采用Bland-Altman法，計(jì)算一致性限度，評價(jià)兩種檢測結(jié)果的一致性。一致性限度應(yīng)在臨床所能接受的界值范圍內(nèi)。

6.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑的檢測結(jié)果有不一致（檢測結(jié)果差異較大）的樣本，可采用臨床上公認(rèn)較好的第三種同類試劑進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

7.臨床試驗(yàn)報(bào)告撰寫

根據(jù)《醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求撰寫臨床試驗(yàn)小結(jié)與報(bào)告，并且滿足簽章等要求。

（五）產(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1試劑盒用于定量檢測人血清、血漿等樣本中的HBV DNA，適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報(bào)產(chǎn)品的分析性能評估和臨床研究情況進(jìn)行確認(rèn)。明確說明該檢測試劑不得用于血源篩查。

1.2臨床用途：主要適用于接受抗病毒治療的乙型肝炎患者，通過對乙型肝炎患者血中HBV DNA基線水平和變化情況的監(jiān)測，用于評估抗病毒治療的應(yīng)答和治療效果監(jiān)測。

  如有其他用途（如隱匿性感染的輔助診斷）則應(yīng)對產(chǎn)品適應(yīng)癥人群、預(yù)期用途另行說明，并提供與之相應(yīng)的分析性能評估以及臨床驗(yàn)證等資料。本指導(dǎo)原則內(nèi)容僅針對治療監(jiān)測用途進(jìn)行要求。

1.3說明相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法；說明與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥及背景情況；說明被測分析物與臨床適應(yīng)癥的關(guān)系。應(yīng)當(dāng)說明該試劑檢測結(jié)果不得作為患者病情評價(jià)的唯一指標(biāo)，必須結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒所包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，如校準(zhǔn)品、陰/陽性質(zhì)控品含有人源組分，應(yīng)提供其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但該項(xiàng)檢測必需的組分，說明書中應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、注冊證號或備案號（如有）及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、備案號（如有）以及配套儀器等詳細(xì)信息。

2.4校準(zhǔn)品應(yīng)明確溯源性。

3.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲存條件及效期。

4.【樣本要求】

4.1樣本收集要求：結(jié)合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現(xiàn)行版）推薦的采樣要求。

4.2血液樣本應(yīng)當(dāng)說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。

4.3樣本處理、運(yùn)送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運(yùn)送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。如有需要應(yīng)對高于檢測范圍的樣本稀釋方法進(jìn)行規(guī)定。

5.【適用機(jī)型】注明所有適用的儀器型號

6.【檢驗(yàn)方法】詳細(xì)說明試驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

6.1試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項(xiàng)。

6.2詳述待測樣本、相關(guān)校準(zhǔn)品及質(zhì)控品核酸提取的條件、步驟及注意事項(xiàng)。

6.3核酸提取/純化方法的詳細(xì)介紹。

6.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

6.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。

6.6儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況對待測基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。

6.7基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

6.8校準(zhǔn)方法的描述。

6.9試驗(yàn)的有效性判斷：試劑盒內(nèi)陰/陽性質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)的Ct值要求。

7.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用IU/ml表示，結(jié)合陰、陽性質(zhì)控結(jié)果，對低于檢出限未檢出、低于定量限、檢測范圍內(nèi)及高于檢測范圍的檢測結(jié)果分別進(jìn)行界定。

8．【檢驗(yàn)方法的局限性】

8.1本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

8.2不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存及處理過程均有可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的檢測結(jié)果。

8.3明確該試劑僅限于規(guī)定的樣本類型及適用機(jī)型。

9.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

9.1對相應(yīng)國家參考品的符合情況。

9.2最低檢出限及定量限：說明試劑不同樣本類型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡單介紹最低檢出限/定量限的確定方法以及對最低檢出限/定量限驗(yàn)證所采用的基因型。

9.3精密度：對精密度的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

9.4線性范圍：確定線性范圍的方法、濃度范圍、相關(guān)系數(shù)等信息。

9.5包容性：對不同基因型的覆蓋，驗(yàn)證該試劑對HBV不同基因型的檢測效果。

9.6特異性：

9.6.1臨床特異性：應(yīng)采用一定數(shù)量的臨床HBV DNA陰性樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

9.6.2交叉反應(yīng)：易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體核酸的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

9.6.3干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等，應(yīng)注明可接受的最高限值。

9.6.4藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結(jié)果的影響，如未進(jìn)行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說明。

9.7臨床試驗(yàn)：簡要介紹臨床試驗(yàn)方法和結(jié)果。

10.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

10.1有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)校準(zhǔn)品、質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項(xiàng)目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項(xiàng)檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對待。

10.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》配備設(shè)備及操作人員，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

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