附件：結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則（2015年第65號）.doc

結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是對結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)、標準的不斷完善和科學技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導原則相關內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、范圍

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和非洲分枝桿菌等引起的慢性傳染性疾病，可累及全身各個器官，以肺結(jié)核最為多見。其中，結(jié)核病的病原菌主要是結(jié)核分枝桿菌，牛結(jié)核分枝桿菌次之。結(jié)核分枝桿菌主要是經(jīng)空氣傳播，大多數(shù)人在感染結(jié)核分枝桿菌后并無癥狀，稱為潛伏感染。潛伏感染可持續(xù)幾十年，僅有5%—10%的潛伏感染者發(fā)展為活動性肺結(jié)核。

在結(jié)核病的細菌學檢驗中，通常將分枝桿菌分為結(jié)核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosis complex）和非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculosis mycobacteria, NTM）。結(jié)核分枝桿菌復合群包括結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）、牛結(jié)核分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti）。在結(jié)核分枝桿菌復合群內(nèi)各種中，除田鼠分枝桿菌對人無致病力外，其他三種菌均可對人致病，產(chǎn)生大致相同的臨床表現(xiàn)。因此，臨床上往往只做結(jié)核分枝桿菌復合群的鑒定而不進行亞種水平的鑒定，用于結(jié)核輔助診斷的核酸檢測試劑也常采用結(jié)核分枝桿菌復合群共有的核酸序列作為靶標來進行檢測。

核酸檢測是肺結(jié)核病原學診斷的重要參考。2009年，美國疾病控制預防中心（CDC）更新了肺結(jié)核的診療指南，將核酸檢測作為肺結(jié)核的輔助診斷方法，明確：對所有疑似肺結(jié)核患者，應至少進行一個呼吸道樣本的核酸檢測。我國《臨床診療指南—結(jié)核病分冊》也明確：結(jié)核分枝桿菌的DNA檢測可作為肺結(jié)核診斷的參考。與其他實驗室檢查方法比較，核酸檢測的價值在于：（1）可快速鑒別結(jié)核分枝桿菌復合群與非結(jié)核分枝桿菌，提高涂片陽性肺結(jié)核的診斷特異性；（2）與涂片比較，靈敏度較高，可提高涂片陰性肺結(jié)核的檢出率；（3）與培養(yǎng)相比，操作快速，可及早進行正確的醫(yī)療處置。

結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑是指：利用分子生物學檢測技術(shù)，如聚合酶鏈式反應（PCR）等，以特定的結(jié)核分枝桿菌復合群共有的核酸序列為檢測靶標，對痰、支氣管肺泡灌洗液中的結(jié)核分枝桿菌復合群進行體外定性檢測的試劑，用于肺結(jié)核的輔助診斷。

本指導原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對于其他分子生物學檢測技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則適用于以結(jié)核分枝桿菌復合群共有的靶核酸序列作為靶標進行檢測的試劑，對于某些以結(jié)核分枝桿菌特有的靶核酸序列為靶標進行檢測的試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則適用于預期用途為肺結(jié)核輔助診斷的、以痰或支氣管肺泡灌洗液作為適用樣本類型的結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑。對于用途相同的其他呼吸道樣本類型，或者預期用途為肺外結(jié)核輔助診斷的結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及國內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應著重從方法學、檢驗原理、最低檢測限及被測靶核酸序列的特性等方面寫明申報試劑與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若被測物為新的靶核酸序列，則應詳細論述作為檢測靶標的核酸序列的臨床意義，即其與臨床應用（可用于肺結(jié)核輔助診斷）的相關性，并提供充分的支持資料。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料的研究資料

應提供主要原材料如引物、探針、酶、陰性對照、陽性對照以及企業(yè)參考品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標準等的研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定；如主要原材料購自其他供貨商，應提供的資料包括：供貨商提供的質(zhì)量標準、出廠檢定報告或性能指標證書，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

申請人應提供企業(yè)參考品的詳細制備過程，包括組成、來源、菌株特性（如名稱、種屬、靶核酸的拷貝數(shù)、濃度等）等信息。企業(yè)參考品的項目應包括：陰性參考品、陽性參考品、最低檢測限參考品、重復性參考品等。陽性參考品應著重考慮結(jié)核分枝桿菌復合群的代表菌株，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應）的驗證情況。建議采用滅活的菌株建立企業(yè)參考品，不宜采用質(zhì)粒、菌株的基因組提取/純化物等核酸或臨床樣本（如痰液）。

申報試劑的質(zhì)控體系通過設置陽性、陰性、內(nèi)對照（內(nèi)標）等各種對照來實現(xiàn)，需考慮對樣本核酸提取/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴增反應抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果的質(zhì)量控制。陽性對照的核酸性質(zhì)應與待測樣本的核酸性質(zhì)一致，如同為RNA或DNA。企業(yè)應對各種對照的Ct值或相應判斷數(shù)值做出明確的范圍要求。申報資料應詳細描述對照的原料選擇、制備、定值過程等試驗資料。

本指導原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對于采用該方法學的結(jié)核核酸檢測試劑，建議至少設置陽性對照、陰性對照和內(nèi)對照。

1.內(nèi)對照（內(nèi)標）

內(nèi)對照可對實驗過程可能存在的擴增反應抑制物、儀器、試劑和操作等所導致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制。內(nèi)對照可采用不含靶核酸序列的質(zhì)?；蚓€性DNA、非結(jié)核分枝桿菌復合群的病原體或克隆菌株，靶核酸為RNA時可采用假病毒等。申請人應對內(nèi)對照（內(nèi)標）的引物、探針和模板濃度做精確的驗證，既要保證內(nèi)標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶核酸序列檢測造成的抑制而導致假陰性。

2.陽性對照

陽性對照可對實驗過程進行質(zhì)控。陽性對照可為：含有靶核酸序列的核酸、含有靶核酸序列的結(jié)核分枝桿菌復合物菌株或其他克隆菌株，靶核酸為RNA時可采用假病毒等。企業(yè)應對各種陽性對照的Ct值或相應判斷數(shù)值做出明確的范圍要求。

3.陰性對照

陰性對照對可能存在的交叉污染進行假陽性結(jié)果的質(zhì)控。陰性對照可以是空白對照。陰性對照需參與樣本核酸的平行提取/純化。

由于申報試劑所適用的臨床樣本比較復雜，其中可能含有各種影響PCR反應的抑制物，從而影響后續(xù)試驗結(jié)果，造成假陰性的可能性。因此，申報試劑應充分考慮對樣本核酸提取/純化環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，通過設置各種對照進行質(zhì)控。比如，采用克隆菌株作為內(nèi)對照，或者采用菌株作為陽性對照并參與樣本核酸的平行提取/純化，或者設置專門的核酸提取/純化對照（如菌株）等，以對樣本核酸提取/純化的質(zhì)量及效率進行評估。

4.核酸提取/純化組分（如適用）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

5.PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶、內(nèi)標及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標準及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

5.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的詳細驗證資料。

5.2引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對序列準確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等的驗證資料。如為外購，應提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

5.3探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進行標記，如熒光素報告基團或其他發(fā)光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應達到高效液相色譜純。如為外購，應提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜；應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學發(fā)光物進行核實，并作HPLC分析。

5.4 PCR反應所需酶

DNA聚合酶，應具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應對酶活性有合理驗證；應提供有關保存穩(wěn)定性、活性及功能實驗等的驗證資料。

6.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（Dnase）或核糖核酸酶（Rnase）污染。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對pH、電導率等關鍵參數(shù)進行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究資料應能對反應體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本用量、試劑用量、反應條件、質(zhì)控體系設置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應原理介紹。
　　3.基因序列的選擇、PCR方法學特性介紹。

4.核酸提取/純化方法確定的研究資料。

5.確定最佳PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量及反應體積等。
　　6.確定PCR反應各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。
　　7.對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

（四）分析性能評估資料

企業(yè)應提交在產(chǎn)品研制階段對申報試劑進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體的試驗方法（操作步驟）、內(nèi)控標準、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。對于結(jié)核分枝桿菌復合群核酸定性檢測試劑，建議著重對以下分析性能進行研究。

1.最低檢測限（分析靈敏度）

1.1最低檢測限的確定

建議使用結(jié)核分枝桿菌標準菌株、牛結(jié)核分枝桿菌標準菌株或BCG標準菌株（如適用）的梯度稀釋液來確定最低檢測限。每個梯度進行不少于20次的重復檢測，將具有95%陽性檢出率的菌株濃度作為最低檢測限。應明確每份菌株的來源、基因型特性、濃度、制備方法等信息。企業(yè)可采用鋪板計數(shù)細菌集落形成單位（colony forming unit，CFU）的方法進行菌株濃度的確認，以CFU/mL作為菌株濃度的表示方式；也可采用國家參考品對菌株濃度進行標定，以“個菌/mL”作為菌株濃度的表示方式。

為確定痰樣本的最低檢測限，建議將已知濃度的菌株與結(jié)核分枝桿菌復合群陰性的痰樣本進行混合，完全按照申報試劑的操作步驟對此“制備痰液”進行樣本前處理、核酸提取/純化、擴增等。對結(jié)核分枝桿菌復合群陰性痰樣本的確認，應采用涂片、培養(yǎng)鑒定、臨床診斷和其他已上市的核酸檢測試劑盒進行聯(lián)合確認。最低檢測限的濃度應是“制備痰液”的最終菌株濃度。

1.2最低檢測限的驗證

應在最低檢測限的菌株濃度對結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌或BCG菌株（如適用）進行至少20次的重復試驗驗證，每種菌株的陽性檢出率為95%。企業(yè)應能夠提供用于最低檢測限驗證的各個菌株的來源、制備方法及濃度等信息?！白畹蜋z測限的驗證”的試驗方法可參考“最低檢測限的確定”。

2.分析特異性

2.1交叉反應

用于結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體。主要包括：非結(jié)核分枝桿菌復合群（NTM）、常見的口腔和呼吸道共生的病原體等，具體目錄參見表1和表2。

建議在病原體感染的醫(yī)學相關水平進行交叉反應的驗證。建議進行交叉反應驗證的分枝桿菌、細菌或者真菌的最低濃度為106 CFU/mL；進行交叉反應驗證的病毒的最低濃度為105 PFU/mL（plaque forming unit，PFU，空斑形成單位）。應提供用于交叉反應驗證的病原體的制備方法、來源、種屬和濃度等信息。

對于某些難以培養(yǎng)或者因為生物安全性無法培養(yǎng)的病原體，可采用病原體核酸樣本進行交叉反應的驗證。應提供用于交叉反應驗證的病原體核酸的來源、組成和濃度等信息。采用病原體核酸樣本進行試驗時，應將核酸樣本視為實際使用過程中參與PCR反應的核酸樣本，根據(jù)試劑說明書的要求配制PCR反應體系，進行擴增。

有關交叉反應驗證的信息應以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標】項中體現(xiàn)。

表1  用于交叉反應研究的其他分枝桿菌

（非結(jié)核分枝桿菌復合群的其他分枝桿菌）

注：表中所列細菌均應進行驗證。

表2  用于交叉反應研究的其他病原體

注：表中所列病原體均應進行驗證。

2.2干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（如血液、粘液、人細胞等）和外源性藥物。

建議使用醫(yī)學相關水平的干擾物濃度進行驗證，另外，建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(最差條件)條件下進行評價。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應藥物藥代動力學研究確定的治療藥物濃度添加相應藥物進行干擾驗證。

表3  用于干擾研究的外源性藥物

注：表中所列外源性藥物均應進行驗證，括號內(nèi)至少選做一種。

3.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標準可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性。具體實驗方法可以參考國內(nèi)或國外的相關文件進行。企業(yè)應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數(shù)的范圍等。針對申報試劑的精密度評價主要包括以下要求。

3.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑（包括提取/純化組分和PCR組分）本身的影響外，還應對不同的適用機型（如PCR分析儀）、操作者、地點等要素進行相關的驗證。

3.2合理的精密度評價周期，例如：為期至少12天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

3.3建議采用結(jié)核分枝桿菌標準菌株（“3.3.1陰性樣本”不適用）作為樣本，在以下3個濃度水平進行驗證：

3.3.1陰性樣本：不含結(jié)核分枝桿菌標準菌株的樣本，陰性檢出率應為100%（n≥20）。
　  3.3.2弱陽性樣本：結(jié)核分枝桿菌標準菌株濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應高于95%（n≥20）。

3.3.3中等陽性樣本：結(jié)核分枝桿菌標準菌株濃度約為最低檢測限的2倍或3倍，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。

4.反應性（包容性）

應證明申報試劑可以檢測代表不同基因多態(tài)性的結(jié)核分枝桿菌復合群菌株。應至少對結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌或BCG菌株(如適用)、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌進行驗證。應采用略高于最低檢測限濃度的結(jié)核分枝桿菌復合群菌株進行研究。應提供各個菌株的來源、菌株特性及濃度等信息。應證明所有采用的菌株含有靶核酸序列。

5.不同樣本類型、樣本前處理方法、核酸提取/純化方法的分析性能資料要求

由于痰和支氣管肺泡灌洗液樣本之間差異較大，如申報試劑同時包括這兩種樣本類型，申請人應提交每種樣本類型的全項目分析性能評估資料。

對于每種樣本類型而言，申請人應提交適用的樣本前處理方法（進行全項目分析性能評估的樣本前處理方法除外）與后續(xù)試驗配合進行的性能試驗（至少包括最低檢測限項目），以證明不同的樣本前處理方法不會影響檢測結(jié)果。

對于每種樣本類型而言，申請人應提供適用的核酸提取/純化方法（進行全項目分析性能評估的核酸提取/純化方法除外）與后續(xù)試驗配合進行的性能試驗（至少包括最低檢測限和精密性項目），以證明不同的核酸提取/純化方法不會影響檢測結(jié)果。

如果申報試劑同時適用于幾種不同的臨床樣本類型、樣本前處理方法和核酸提取/純化方法，每種樣本類型應明確其適用的樣本前處理方法（一種或幾種）和核酸提取/純化方法（一種或幾種）。如果申報試劑最終僅保留某種樣本類型、某種樣本前處理方法和某種核酸提取/純化方法，分析性能評估資料應采用該組合進行。

6.注意事項

對于適用多個機型的產(chǎn)品，應提供如產(chǎn)品說明書【適用儀器】項中所列的所有型號儀器的至少三批全性能評估資料。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值確定資料主要是指Ct值的確認資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報試劑用于結(jié)果判斷的臨界值。有關ROC曲線分析的細節(jié)，請參考國內(nèi)外相關的文件。如存在灰區(qū)，應提交灰區(qū)上下限確定的詳細的研究資料。

（六）穩(wěn)定性研究資料
　  穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

申請人應對樣本穩(wěn)定性進行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇3—5個溫度點（應至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行分析性能驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。用于樣本穩(wěn)定性研究的樣本應包括最低檢測限濃度的樣本。除了定性結(jié)果之外，還需要提供原始信號的分析，如Ct。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數(shù)進行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床試驗

1.臨床試驗機構(gòu)的選擇

申請人應當選定不少于3家（含3家）臨床試驗機構(gòu)，按照有關規(guī)定開展臨床試驗。臨床試驗機構(gòu)應獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局資質(zhì)認可。申請人應根據(jù)產(chǎn)品特點及其預期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學背景、病原微生物的特性等因素選擇臨床試驗機構(gòu)。臨床試驗機構(gòu)必須具有與申報試劑相適應的專業(yè)技術(shù)人員及儀器設備，并能夠確保該項試驗的實施。

2.臨床試驗樣本的選擇和樣本量

臨床試驗對象的選擇應滿足如下條件：（1）具有肺結(jié)核癥狀/體征的疑似肺結(jié)核患者病例，不建議選擇正常健康人群；（2）最終臨床診斷為肺結(jié)核患者的病例不少于350例，并且涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例應不小于50%；（3）應包括其他易混淆疾病的病例（最終臨床診斷確定不是肺結(jié)核），以對申報試劑的特異性進行評價，此部分病例不少于150例；（4）每個臨床試驗對象的臨床樣本應足量，以便同時進行申報試劑、對比試劑和其他合理方法的檢測。

鑒于痰和支氣管肺泡灌洗液樣本之間的差異較大，如果申報試劑同時適用于兩種樣本類型，每種樣本類型的例數(shù)不少于500例。

臨床試驗應以新鮮樣本為主，如采用凍存樣本應另行說明。

如果某種樣本類型適用于多種樣本前處理方法，應進行不少于150例同源樣本的對比試驗，證明不同的樣本前處理方法不會影響檢測結(jié)果。其中，最終臨床診斷為肺結(jié)核患者的病例不少于100例，涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例不小于50%，其他易混淆疾病的病例（最終臨床診斷確定不是肺結(jié)核）不少于50例。

如果某種樣本類型適用于多種核酸提取/純化方法，應進行不少于150例同源樣本的對比試驗，證明不同的核酸提取/純化方法不會影響檢測結(jié)果。其中，最終臨床診斷為肺結(jié)核患者的病例不少于100例，涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例不小于50%，其他易混淆疾病的病例（最終臨床診斷確定不是肺結(jié)核）不少于50例。

3.對比試劑的選擇

3.1對于“已有同品種批準上市”試劑的臨床試驗，申請人可按照法規(guī)要求選擇境內(nèi)已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用申報試劑與對比試劑進行比較研究試驗，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。同時，申請人還應選擇一定數(shù)量的臨床樣本進行申報試劑與培養(yǎng)鑒定方法的對比研究，每種樣本類型不少于100例，其中涂片陰性和陽性各至少50例。培養(yǎng)方法可采用傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)方法或臨床普遍認可的液體培養(yǎng)方法，菌種鑒定方法可采用對硝基苯甲酸（p-methylbenzylsulfonyl，PNB）、測序、高性能的液相層析、質(zhì)譜、或其他已上市的核酸檢測試劑盒方法。臨床研究報告應對采用的培養(yǎng)鑒定方法做詳細介紹。

3.2對于無法選擇對比試劑的新結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑，其臨床試驗應選擇培養(yǎng)鑒定和/或核酸序列測定（測序）方法作為對比方法，總例數(shù)不少于500例。

3.2.1 有關培養(yǎng)鑒定方法的要求同3.1。

3.2.2 臨床研究報告應對選用的測序方法做詳細介紹。申請人應提供以下關于測序部分的詳細試驗資料，需由臨床試驗機構(gòu)簽章確認。

3.2.2.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

3.2.2.2測序方法所用引物相關信息，如核酸序列選擇、分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設計應合理涵蓋申報試劑擴增的靶核酸區(qū)段。

3.2.2.3 對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與申報試劑的相關性能進行適當比對分析。

3.2.2.4 測序方法應建立合理的陽性和陰性質(zhì)控品，以對臨床樣本的檢測結(jié)果進行質(zhì)量控制。

3.2.2.5 提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

如果申報試劑同時適用于幾種不同的臨床樣本類型、樣本前處理方法和核酸提取/純化方法，每種樣本類型應明確規(guī)定其適用的樣本前處理方法（一種或幾種）和核酸提取/純化方法（一種或幾種）。如果申報試劑最終僅保留某種樣本類型、某種樣本前處理方法和某種核酸提取/純化方法，臨床試驗應采用該組合進行。

4.臨床試驗方法、臨床數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析

4.1應在臨床試驗方案或者臨床試驗報告中詳細描述申報試劑和對比試劑的具體操作步驟。應明確每個試驗陰陽性的判定標準，特別應明確何為培養(yǎng)鑒定的陰陽性。

4.2在臨床報告中，以列表的方式，明確：總樣本例數(shù)、臨床診斷為肺結(jié)核的患者總例數(shù)、涂片陰性的肺結(jié)核患者例數(shù)、涂片陽性的肺結(jié)核患者例數(shù)、非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者與易混淆疾病樣本例數(shù)，以判斷病例選擇的科學合理性。

4.3臨床試驗數(shù)據(jù)應以列表的方式表示，包括每個樣本的涂片結(jié)果、臨床診斷結(jié)果、申報試劑的結(jié)果、對比試劑的結(jié)果。

4.4對臨床試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計應選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。

4.5申報試劑對涂片陰性的肺結(jié)核患者應有一定的檢出率；申報試劑對涂片陽性肺結(jié)核患者的檢出率至少為90%；申報試劑的臨床特異性至少為90%。

4.6臨床試驗中的某些樣本，采用申報試劑檢測時為陽性，采用培養(yǎng)鑒定方法檢測時為陰性，出現(xiàn)這種情況的原因有：樣本前處理導致結(jié)核菌的培養(yǎng)受抑制；樣本中結(jié)核菌的濃度過低。這可能導致申報試劑的特異性低。因此，在進行4.4統(tǒng)計分析的同時，建議進行申報試劑與最終臨床診斷的對比統(tǒng)計分析，以客觀地反應申報試劑的臨床特異性。

對于申報試劑與對比試劑（或?qū)Ρ确椒ǎ┑牡刃栽u價，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學差異。在臨床試驗方案中應明確統(tǒng)計檢驗假設，即評價申報試劑與對比試劑（或?qū)Ρ确椒ǎ┦欠竦刃У臉藴省?/p>

5.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應采用金標準或其他合理方法進行復核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。如無需復核，應詳細說明理由。

6.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究者應從流行病學、統(tǒng)計學、臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學等多方面考慮，設計科學合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構(gòu)的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的樣本入選/排除標準，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各臨床試驗機構(gòu)選用的對比試劑應保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。另外，申報試劑的樣本類型不應超越對比試劑對樣本類型的檢測要求。

7.臨床試驗報告的撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床試驗報告中對以下內(nèi)容進行詳述。

7.1臨床試驗總體設計及方案描述

7.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床試驗機構(gòu)選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

7.1.2病例的納入/排除標準。

7.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存；痰液的培養(yǎng)、鑒定方法；培養(yǎng)鑒定陰性、陽性的具體涵義等。

7.1.4統(tǒng)計學方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標準。

7.2具體臨床試驗情況

7.2.1申報試劑和對比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息。

7.2.2對各試驗機構(gòu)的病例數(shù)等情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

7.2.3質(zhì)量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、質(zhì)控品運行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

7.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本的保存條件、結(jié)果不一致樣本的校驗等。

7.3統(tǒng)計學分析

7.3.1數(shù)據(jù)預處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或其他合理方法的復核以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

7.3.2陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。

7.3.3以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

7.4討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床試驗有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》的相關規(guī)定。申請人應按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導原則》的有關要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求，內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標和檢驗方法，并在附錄中明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。

產(chǎn)品技術(shù)要求中的產(chǎn)品性能指標應與說明書中相關內(nèi)容保持一致。如申報試劑已有相應的國家或行業(yè)標準發(fā)布，則產(chǎn)品技術(shù)要求不得低于上述標準要求。

（九）注冊檢驗

根據(jù)《辦法》要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應在具有相應醫(yī)療器械檢驗資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。如申報試劑有適用的國家參考品，應采用國家參考品進行注冊檢驗，并符合國家參考品的相關要求。

（十）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地編制說明書。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1試劑盒用于體外定性檢測人xx樣本中的結(jié)核分枝桿菌復合群核酸。

1.2簡單介紹結(jié)核分枝桿菌復合群包括哪些種的細菌、致病性、感染后的臨床表現(xiàn)，靶核酸序列的特征（名稱和基因位置等）及選擇依據(jù)，其他病原體（如：非結(jié)核分枝桿菌NTM）中是否存在靶核酸序列。

1.3待測人群特征介紹：具有肺結(jié)核相關體征/癥狀和X線檢查結(jié)果的疑似結(jié)核病患者、地域要求或年齡限制（如有）等。

1.4強調(diào)：實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業(yè)培訓，具備相關的實驗操作資格，實驗室應具備相應的生物安全防護條件。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組份，企業(yè)應列出相關試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取/純化的試劑組份，則應在此注明經(jīng)過驗證后推薦配合使用的商品化核酸提取/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號、醫(yī)療器械注冊證號等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒檢測的靶核酸序列進行詳細描述（名稱和基因位置等），對不同樣品反應管組合、對照設置及熒光信號檢測原理等進行逐項介紹。

3.2核酸提取/純化方法、原理等。

3.3試劑盒技術(shù)原理的詳細介紹，建議結(jié)合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理作適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復融穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應明確具體的儲存條件及有效期。

5.【樣本要求】重點明確以下內(nèi)容：

5.1樣本的收集：應參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊）》（中華醫(yī)學會編著）或者《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會編著）現(xiàn)行有效版本推薦的采樣要求，并詳細描述采樣步驟和注意事項。

5.2臨床樣本的前處理（如適用）：應參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊）》（中華醫(yī)學會編著）或者《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會編著）現(xiàn)行有效版本推薦的前處理方法，尤其是痰標本，如堿處理-直接法、N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）-NaOH法等，詳細描述具體的前處理方法。

5.3樣本的其他處理、運送和保存：明確核酸提取/純化前的其他處理（如離心、洗滌等）、保存條件及期限（短期、長期）、運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數(shù)的限制。

6.【適用儀器】所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度、空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法、注意事項。

7.3詳述待測樣本及相關對照核酸提取/純化的條件、步驟及注意事項（如適用）。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設置、循環(huán)數(shù)設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6儀器設置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標記情況、對待測基因及內(nèi)標的熒光通道選擇。

7.7基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法或相應的自動化檢測程序。

8.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照、內(nèi)對照（內(nèi)標）、核酸提取/純化對照（如適用）以及樣本管檢測結(jié)果的Ct值，以列表的形式對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應的解釋進行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應詳述對于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

9.2有關假陰性結(jié)果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運送及處理、樣本中細菌含量過低均有可能導致假陰性結(jié)果。

9.2.2待測靶核酸的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙е录訇幮越Y(jié)果。

9.2.3未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結(jié)果（如有）。

9.3有關假陽性結(jié)果的可能性分析

除結(jié)核分枝桿菌復合群外，其他病原體可能含有靶核酸序列，因而導致假陽性，列出可能導致假陽性結(jié)果的病原體目錄。

10.【產(chǎn)品性能指標】詳述以下性能指標：

10.1對國家參考品檢測的符合情況，簡要描述采用國家參考品進行檢測的結(jié)果（如適用）。

10.2最低檢測限：說明試劑的最低檢出濃度，簡單介紹最低檢測限的試驗方法及結(jié)果。

10.3企業(yè)陽性、陰性參考品的檢測符合情況，簡單介紹陰陽性參考品的組成、濃度和符合率結(jié)果等信息。

10.4精密度：精密度參考品的組成、濃度及結(jié)果。

10.5分析特異性

10.5.1交叉反應：對出現(xiàn)在相應臨床標本中可能產(chǎn)生交叉反應的其他病原體的驗證情況，建議以列表的方式明確經(jīng)過交叉反應驗證的病原體名稱、菌株特性、濃度等信息；

10.5.2干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血液、粘液或藥物等；

10.6對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

10.7境外（如適用）和境內(nèi)臨床試驗數(shù)據(jù)總結(jié)。

11【注意事項】應至少包括以下內(nèi)容：

11.1有關人源組份（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)xx組份可能含有人源物質(zhì)，雖已經(jīng)通過了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組分作為潛在傳染源對待。

11.2臨床實驗室應嚴格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號，或現(xiàn)行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、名詞解釋

1.聚合酶鏈式反應 polymerase chain reaction, PCR

聚合酶鏈式反應或多聚酶鏈式反應是一種對特定的DNA或RNA片段在體外進行快速擴增的方法。由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構(gòu)成。

2.熒光探針PCR

在PCR過程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產(chǎn)物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達到對原始模板量進行分析的PCR。

3.分析特異性 analytical specificity

測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學相關濃度值水平的分析干擾程度。注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應物。

4.精密度 precision

在規(guī)定條件下，相互獨立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

5.最低檢測限 detection limit, limit of detection

樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測量的最低值。

6.閾值循環(huán)數(shù) cycle threshold, Ct

實時監(jiān)測擴增過程中，反應管內(nèi)的熒光信號到達指數(shù)擴增時經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計算方式是以擴增過程前3到15個循環(huán)的熒光值的10倍標準差為閾值，當熒光值超過閾值時的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。

7.內(nèi)標 internal control

在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。